Hyperglykemische klem en hypoglykemische klem bij bewuste muizen
Summary
Een hyperglykemische klem wordt gebruikt voor het meten van de insulineafgifte bij een aangehouden hogere bloedglucoseconcentratie. Een hypoglykemische klem is voor het meten van de glucoseproductie die wordt geïnduceerd door tegenregulerende reacties. Beide methoden maken gebruik van dezelfde chirurgische ingreep. Hier presenteren we een klemtechniek om het systemische glucosemetabolisme te beoordelen.
Abstract
Diabetes mellitus (DM) wordt veroorzaakt door onvoldoende insulineafgifte uit de β-cellen van de alvleesklier (Type1 DM) en insulinegevoeligheid in spieren, lever en vetweefsel (Type2 DM). Insuline-injectie behandelt DM-patiënten, maar leidt tot hypoglykemie als bijwerking. Cortisol en catecholamines worden vrijgegeven om de glucoseproductie uit de lever te activeren om hypoglykemie te herstellen, de zogenaamde contraregulerende reacties (CRR). In DM-onderzoek met behulp van knaagdiermodellen worden glucosetolerantietests en 2-deoxy-glucose-injectie gebruikt om respectievelijk de insulineafgifte en CRR te meten. De bloedglucoseconcentraties veranderen echter voortdurend tijdens experimenten, waardoor het moeilijk wordt om de netto insulineafgifte en CRR te beoordelen. Dit artikel beschrijft een methode waarbij de bloedglucose bij bewuste muizen op 250 mg/dL of 50 mg/dL wordt gehouden om de afgifte van respectievelijk insuline- en CRR-hormonen te vergelijken.
Polyethyleen slangen worden geïmplanteerd in de halsslagader en halsader van de muizen en de muizen mogen herstellen van de operatie. De halsaderslang is verbonden met een Hamilton-spuit met een spuitpomp om insuline- of glucose-infusie met een constante en variabele snelheid mogelijk te maken. De slang van de halsslagader is bedoeld voor bloedafname. Voor de hyperglykemische klem wordt 30% glucose in de ader toegediend en worden de bloedglucosewaarden elke 5 minuten of 10 minuten gemeten uit het arteriële bloed. De infusiesnelheid van 30% glucose wordt verhoogd totdat de bloedglucosespiegel 250 mg/dL wordt. Er wordt bloed afgenomen om de insulineconcentraties te meten. Voor hypoglykemische klem wordt insuline van 10 mU/kg/min toegediend samen met 30% glucose, waarvan de infusiesnelheid variabel is om de bloedglucosespiegel van 50 mg/dL te behouden. Bloed wordt verzameld om tegenregulerende hormonen te meten wanneer zowel glucose-infusie als bloedglucose een stabiele toestand bereiken. Zowel hyperglykemische als hypoglykemische klemmen hebben dezelfde chirurgische ingreep en experimentele opstellingen. Deze methode is dus nuttig voor onderzoekers van systemisch glucosemetabolisme.
Introduction
Glucose is een belangrijke energiebron voor cellen en een gebrek aan glucose kan leiden tot verschillende symptomen en complicaties. In het geval van een lage glucose (hypoglykemie, over het algemeen minder dan 70 mg/dL in nuchtere bloedglucosespiegel, maar mag niet worden bepaald door een enkele waarde1), zijn de meest voorkomende symptomen zwakte, verwardheid, zweten en hoofdpijn. Het kan ook de hersenfunctie verstoren en het risico op cardiovasculaire gebeurtenissen en mortaliteitverhogen2. Omgekeerd is hyperglykemie een medische aandoening waarbij de plasmaglucoseconcentratie de normale niveaus overschrijdt (over het algemeen > 126 mg/dL bij nuchtere bloedglucosespiegel3). Dit kan voorkomen bij personen met diabetes die een tekort hebben in de insulineproductie of -gebruik. Hyperglykemie kan leiden tot diabetische ketoacidose, die optreedt wanneer het lichaam glucose niet kan gebruiken voor energie, maar in plaats daarvan vetzuren afbreekt als brandstof. De hyperglykemische hyperosmolaire toestand verhoogt ook de mortaliteit4. Langdurige hyperglykemie kan schade aan bloedvaten, zenuwen en organen veroorzaken, wat leidt tot de ontwikkeling van verschillende chronische complicaties zoals hart- en vaatziekten, retinopathieën en nieraandoeningen. De bloedglucoseconcentratie moet dus binnen een strak bereik tussen 100 mg/dL en 120 mg/dL worden gehouden.
De bloedglucose wordt gereguleerd door de balans tussen de input en output van glucose in een model met één compartiment (Figuur 1A). Glucose-input omvat geabsorbeerde glucose uit voedsel en glucoseproductie uit de lever, nieren en dunne darm. De glucoseproductie omvat de opname van glucose in weefsels en de afvoer van glucose uit de nieren. Zowel de hoeveelheid glucose-input als -output worden gereguleerd door endocriene hormonen. Glucagon, corticosteron en catecholamines, bekend als tegenregulerende hormonen, komen bijvoorbeeld vrij wanneer de bloedglucosespiegelsdalen5. Ze stimuleren de afbraak van glycogeen en de synthese van glucose, voornamelijk uit de lever; Deze processen staan bekend als respectievelijk glycogenolyse en gluconeogenese. Hyperglykemie verhoogt de insulineafgifte uit β-cellen van de alvleesklier en stimuleert de opname van glucose in de spieren, vetweefsels en het hart 6,7,8,9. Lichaamsbeweging verhoogt de insuline-onafhankelijke glucoseopname10. Het sympathische zenuwstelsel verhoogt de opname van glucose in spieren en bruin vetweefsel 6,11. Om het vermogen om het glucosemetabolisme in perifere weefsels te reguleren te meten, gebruiken onderzoekers meestal de glucosetolerantietest (GTT) en de insulinetolerantietest (ITT) (Figuur 1B,C). Bij GTT moet rekening worden gehouden met twee factoren: insulineafgifte en insulinegevoeligheid (Figuur 1B). De glucoseconcentratiecurve tijdens de test van 120 minuten is echter bij elke muis anders, wat van invloed kan zijn op verschillende hoeveelheden hormoonafgifte. Bij ITT wordt de bloedglucose gereguleerd door zowel de insulinegevoeligheid als de afgifte van tegenregulerende hormonen. Daarom is het moeilijk om de precieze betekenis van glucosemetabolisme, insulineafgifte en insulinegevoeligheid in GTT en ITT te bepalen, in situaties waarin de bloedglucosespiegels niet constant zijn.
Om deze problemen op te lossen, is het wenselijk om de bloedglucose op een constant niveau te houden (of “klem”). Bij hyperglykemische klem wordt glucose in de bloedbaan toegediend om de bloedglucosespiegels tot een bepaald niveau te verhogen en vervolgens gedurende een bepaalde periode op dat niveau te houden. De hoeveelheid geïnfundeerde glucose wordt aangepast op basis van metingen van de bloedglucosespiegels om de 5-10 minuten om een stabiele toestand te behouden. Deze techniek is vooral nuttig voor het begrijpen van de parameters van insulinesecretie bij een geklemd glucosegehalte. Hypoglykemische klem is een methode om lage bloedglucosespiegels te handhaven door insuline toe te dienen. Glucose wordt met een variabele snelheid toegediend om een specifieke bloedglucosespiegel te behouden. Als de muis niet kan herstellen van hypoglykemie, moet meer glucose worden toegediend.
Hoewel er veel voordelen zijn aan het uitvoeren van hyperglykemische en hypoglykemische klemmen, worden de chirurgische en experimentele procedures als technisch moeilijk beschouwd. Er zijn dus maar weinig onderzoeksgroepen die ze hebben kunnen doen. We wilden deze methoden beschrijven voor onderzoekers met financiële en personeelsbeperkingen om deze experimenten met een lager budget te starten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode is een eenvoudige methode die kan worden uitgevoerd met pipetpunten, spuiten en andere items die in gewone laboratoria worden aangetroffen. Hoewel onderzoekers mogelijk extra slangen en pompen moeten aanschaffen, is dure apparatuur niet nodig. Dit protocol van katheterisatie en klemming is dus gemakkelijker te starten in vergelijking met eerdere rapporten 12,13,14.
De klemte…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Leading Initiative for Excellent Young Researchers (van MEXT); een subsidie voor wetenschappelijk onderzoek (B) (subsidienummer JP21H02352); Japans Agentschap voor Medisch Onderzoek en Ontwikkeling (AMED-RPIME, subsidienummer JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); de Uehara Memorial Foundation; Astellas Stichting voor Onderzoek naar Stofwisselingsziekten; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation en Narishige Neuroscience Research Foundation. We danken ook Nur Farehan Asgar, Ph.D, voor het redigeren van een concept van dit manuscript.
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
Referencias
- Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
- Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
- . Leanne Riley Mean fasting blood glucose Available from: https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022)
- Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
- Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
- Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
- Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
- Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -. W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
- Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
- Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
- Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
- Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
- Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
- Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
- Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
- Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
- Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
- Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
- Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
- Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
- Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
- Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
- Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
- TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).
