Deze studie biedt een protocol voor het gebruik van induceerbare osteoblast-lijnspecifieke Stat3-knock-outmuizen om botremodellering onder orthodontische kracht te bestuderen en beschrijft methoden voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens orthodontische tandbeweging, waardoor licht wordt geworpen op de mechanische biologie van het skelet.
Het alveolaire bot, met een hoge omloopsnelheid, is het meest actief remodellerende bot in het lichaam. Orthodontische tandbeweging (OTM) is een veelvoorkomend kunstmatig proces van alveolaire botremodellering als reactie op mechanische kracht, maar het onderliggende mechanisme blijft ongrijpbaar. Eerdere studies zijn niet in staat geweest om het precieze mechanisme van botremodellering in enige tijd en ruimte te onthullen vanwege beperkingen in diermodelgerelateerde beperkingen. De signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) is belangrijk in het botmetabolisme, maar de rol ervan in osteoblasten tijdens OTM is onduidelijk. Om in vivo bewijs te leveren dat STAT3 deelneemt aan OTM op specifieke tijdstippen en in bepaalde cellen tijdens OTM, genereerden we een tamoxifen-induceerbaar osteoblast-lijnspecifiek Stat3 knock-out muismodel, oefenden we orthodontische kracht uit en analyseerden we het alveolaire botfenotype.
Microcomputertomografie (Micro-CT) en stereomicroscopie werden gebruikt om toegang te krijgen tot OTM-afstand. Histologische analyse selecteerde het gebied binnen drie wortels van de eerste kies (M1) in de dwarsdoorsnede van het maxillaire bot als het interessegebied (ROI) om de metabole activiteit van osteoblasten en osteoclasten te evalueren, wat het effect van orthodontische kracht op alveolair bot aangeeft. Kortom, we bieden een protocol voor het gebruik van induceerbare osteoblast-afstammingsspecifieke Stat3-knock-outmuizen om botremodellering onder orthodontische kracht te bestuderen en methoden te beschrijven voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens OTM, waardoor een nieuw licht wordt geworpen op de mechanische biologie van het skelet.
Het is algemeen bekend dat bot gedurende het hele leven voortdurend wordt gereconstrueerd, als reactie op mechanische krachten volgens de wet van Wolff 1,2. Passende mechanische stimulatie, zoals zwaartekracht en dagelijkse lichaamsbeweging, behoudt de botmassa en -sterkte en voorkomt botverlies door zowel osteoblasten als osteoclasten te stimuleren. Osteoclasten, verantwoordelijk voor botresorptie 3,4,5,6,7, en osteoblasten, verantwoordelijk voor botvorming 8,9,10, handhaven de bothomeostase en functioneren gezamenlijk in het biologische proces van botremodellering. Daarentegen, bij afwezigheid van belastingsprikkels, zoals bij astronauten onder langdurige microzwaartekracht, lijden botten aan een verlies van 10% botmineraaldichtheid, waardoor het risico op osteoporose toeneemt11,12. Bovendien zijn niet-invasieve en gemakkelijke mechanische therapieën, waaronder orthodontie en afleidingsosteogenese, naar voren gekomen als behandelingen voor botziekten13,14. Dit alles heeft aangetoond dat mechanische kracht een cruciale rol speelt bij het handhaven van de kwaliteit en kwantiteit van botten. Recente studies analyseerden over het algemeen botremodellering als reactie op mechanische belasting met behulp van tijdrovende modellen zoals loopwiel- en staartophangingstests, die meestal 4 weken of langer duurden om krachtbelasting of -ontlading te simuleren15,16. Daarom is er vraag naar een handig en efficiënt diermodel voor het bestuderen van botremodellering aangedreven door krachtbelasting.
Het alveolaire bot is het meest actief op het gebied van botremodellering, met een hoge omloopsnelheid17. Orthodontische tandbeweging (OTM), een veel voorkomende behandeling voor malocclusie, is een kunstmatig proces van alveolaire botremodellering als reactie op mechanische kracht. OTM, dat snelle botremodellering induceert18, is echter ook een tijdbesparende manier om de effecten van mechanische kracht op botremodellering te bestuderen in vergelijking met andere modellen met een lange experimentele periode. Daarom is OTM een ideaal model om botremodellering onder mechanische stimuli te bestuderen. Het is opmerkelijk dat het mechanisme van alveolaire botremodellering vaak tijdgevoelig is en dat het noodzakelijk is om de veranderingen in alveolaire botremodellering op bepaalde tijdstippen na modellering te observeren. Met de dubbele voordelen van temporele en ruimtelijke controle van DNA-recombinatie en weefselspecificiteit, is een induceerbaar conditioneel gen-knock-outmuismodel een geschikte keuze voor OTM-studies.
Conventioneel is OTM-gemedieerde alveolaire botremodellering onderverdeeld in spanningszones met botvorming en drukzones met botresorptie 19,20,21, wat gedetailleerder is maar moeilijk te reguleren. Verder rapporteerden Yuri et al. dat de tijd van botvorming bij OTM verschilde aan de spannings- en compressiezijde22. Bovendien had een eerdere studie aangetoond dat de eerste kies een brede remodellering van het maxillaire alveolaire bot kon initiëren onder orthodontische kracht, die niet beperkt was tot de spannings- en drukzones23. Daarom selecteerden we het gebied binnen drie wortels van M1 in de dwarsdoorsnede van het maxillaire bot als het interessegebied (ROI) en beschreven we methoden om de activiteit van osteoblasten en osteoclasten in hetzelfde gebied te beoordelen om alveolaire botremodellering onder OTM te evalueren.
Als nucleaire transcriptiefactor is bewezen dat signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) cruciaal is in bothomeostase24,25. Eerdere studies hebben een lage botmineraaldichtheid en terugkerende pathologische fracturen gemeld bij Stat3-mutante muizen26,27. Onze vorige studie toonde aan dat deletie van Stat3 de Osx+ osteoblasten craniofaciale malformatie en osteoporose veroorzaakte, evenals spontane botbreuken28. Onlangs leverden we in vivo bewijs met een induceerbaar osteoblast-specifiek Stat3-deletiemuismodel (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, hierna Stat3Col1α2ERT2 genoemd) dat STAT3 van cruciaal belang is bij het mediëren van de effecten van orthodontische kracht die alveolaire botremodellering aandrijft29. In deze studie bieden we methoden en protocollen voor het gebruik van induceerbare osteoblast-lijnspecifieke Stat3-knock-outmuizen om botremodellering onder orthodontische kracht te bestuderen en methoden te beschrijven voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens OTM, waardoor licht wordt geworpen op de mechanische biologie van het skelet.
Aangezien malocclusie een van de meest voorkomende mondaandoeningen is die de ademhaling, kauwen, spreken en zelfs het uiterlijk aantasten, neemt de vraag naar orthodontie met de dag toe, waarbij de incidentie stijgt van 70% naar 93% volgens een eerder epidemiologisch onderzoek31,32. Hoe de remodellering van alveolair bot kan worden versneld om de efficiëntie van orthodontische behandeling veilig te verhogen, is een hot topic geworden op dit gebied; daarom is he…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); de Natuurwetenschappelijke Stichting van Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); het programma van Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); Klinisch onderzoeksplan van SHDC (SHDC2020CR4084); het Cross-disciplinary Research Fund van het Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116); het Innovation Research Team van lokale universiteiten op hoog niveau in Shanghai (SSMUZLCX20180501); het Fonds voor Onderzoeksdiscipline nr. KQYJXK2020 van het Ninth People’s Hospital, de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine en het College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Origineel exploratieproject van het Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Tweehonderd talentenproject van de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; het Coöperatieve onderzoeksproject van het Biomaterials and Regenerative Medicine Institute Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); het project van de biobank van het Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).
1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
Zoletil | VIRBAC |