استخدام الفئران بالضربة القاضية Stat3 الخاصة بالنسب العظمية لدراسة إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء حركة الأسنان التقويمية
Summary
توفر هذه الدراسة بروتوكولا لاستخدام الفئران بالضربة القاضية Stat3 الخاصة بنسب بانيات العظم لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان وتصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء حركة الأسنان التقويمية ، وبالتالي إلقاء الضوء على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.
Abstract
العظم السنخي ، مع معدل دوران مرتفع ، هو العظم الأكثر نشاطا في إعادة تشكيل الجسم. حركة الأسنان التقويمية (OTM) هي عملية اصطناعية شائعة لإعادة تشكيل العظام السنخية استجابة للقوة الميكانيكية ، لكن الآلية الأساسية تظل بعيدة المنال. لم تتمكن الدراسات السابقة من الكشف عن الآلية الدقيقة لإعادة تشكيل العظام في أي زمان ومكان بسبب القيود المتعلقة بالنماذج الحيوانية. يعد محول الإشارة ومنشط النسخ 3 (STAT3) مهما في استقلاب العظام ، لكن دوره في بانيات العظم أثناء OTM غير واضح. لتقديم دليل في الجسم الحي على أن STAT3 يشارك في OTM في نقاط زمنية محددة وفي خلايا معينة أثناء OTM ، قمنا بإنشاء نموذج فأر Stat3 بالضربة القاضية الخاص بسلالة عقار تاموكسيفين ، وطبقنا قوة تقويم الأسنان ، وحللنا النمط الظاهري للعظام السنخية.
تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT) والفحص المجهري الاستريو للوصول إلى مسافة OTM. اختار التحليل النسيجي المنطقة الواقعة داخل ثلاثة جذور من الضرس الأول (M1) في المقطع العرضي لعظم الفك العلوي كمنطقة الاهتمام (ROI) لتقييم النشاط الأيضي لبانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم ، مما يشير إلى تأثير قوة تقويم الأسنان على العظم السنخي. باختصار ، نحن نقدم بروتوكولا لاستخدام الفئران بالضربة القاضية Stat3 ذات النسب المستحثة لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان ووصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء OTM ، وبالتالي إلقاء ضوء جديد على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.
Introduction
من المعروف عموما أن العظام تخضع لإعادة بناء مستمرة طوال الحياة ، استجابة للقوى الميكانيكية وفقا لقانون وولف 1,2. يحافظ التحفيز الميكانيكي المناسب ، مثل الجاذبية والتمارين اليومية ، على كتلة العظام وقوتها ويمنع فقدان العظام عن طريق تحفيز كل من بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم. تحافظ الخلايا العظمية ، المسؤولة عن ارتشاف العظام3،4،5،6،7 ، وبانيات العظم ، المسؤولة عن تكوين العظام8،9،10 ، على توازن العظام وتعمل بشكل مشترك في العملية البيولوجية لإعادة تشكيل العظام. في المقابل ، في غياب محفزات التحميل ، كما هو الحال في رواد الفضاء تحت الجاذبية الصغرى طويلة الأجل ، تعاني العظام من فقدان كثافة المعادن في العظام بنسبة 10٪ ، مما يزيد من خطر الإصابة بهشاشة العظام11,12. علاوة على ذلك ، ظهرت العلاجات الميكانيكية غير الغازية والمريحة ، بما في ذلك تقويم الأسنان وتكوين العظم المشتت ، كعلاجات لأمراض العظام13،14. كل هذه أظهرت أن القوة الميكانيكية تلعب دورا حاسما في الحفاظ على جودة العظام وكميتها. قامت الدراسات الحديثة بشكل عام بتحليل إعادة تشكيل العظام استجابة للتحميل الميكانيكي باستخدام نماذج تستغرق وقتا طويلا مثل اختبارات تعليق عجلة الجري والذيل ، والتي تستغرق عادة 4 أسابيع أو أكثر لمحاكاة تحميل القوة أو التفريغ15,16. لذلك ، هناك طلب على نموذج حيواني مناسب وفعال لدراسة إعادة تشكيل العظام مدفوعة بتحميل القوة.
العظم السنخي هو الأكثر نشاطا من حيث إعادة تشكيل العظام ، مع معدل دوران مرتفع17. حركة تقويم الأسنان (OTM) ، وهي علاج شائع لسوء الإطباق ، هي عملية اصطناعية لإعادة تشكيل العظام السنخية استجابة للقوة الميكانيكية. ومع ذلك ، فإن OTM ، الذي يحفز إعادة تشكيل العظامبسرعة 18 ، هو أيضا وسيلة موفرة للوقت لدراسة آثار القوة الميكانيكية على إعادة تشكيل العظام مقارنة بالنماذج الأخرى ذات الفترة التجريبية الطويلة. لذلك ، يعد OTM نموذجا مثاليا لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت المحفزات الميكانيكية. من الجدير بالذكر أن آلية إعادة تشكيل العظام السنخية غالبا ما تكون حساسة للوقت ، ومن الضروري ملاحظة التغيرات في إعادة تشكيل العظام السنخية في نقاط زمنية معينة بعد النمذجة. مع المزايا المزدوجة للتحكم الزماني والمكاني في إعادة تركيب الحمض النووي وخصوصية الأنسجة ، يعد نموذج فأر الضربة القاضية للجين الشرطي المستحث خيارا مناسبا لدراسات OTM.
تقليديا ، تم تقسيم إعادة تشكيل العظام السنخية بوساطة OTM إلى مناطق توتر تتضمن تكوين العظام ومناطق ضغط تتضمن ارتشاف العظام19،20،21 ، وهو أكثر تفصيلا ولكن يصعب تنظيمه. علاوة على ذلك ، أفاد يوري وآخرون أن وقت تكوين العظام في OTM يختلف على جانبي التوتر والضغط22. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن الضرس الأول يمكن أن يبدأ إعادة تشكيل واسعة للعظم السنخي الفكي العلوي تحت قوة تقويم الأسنان ، والتي لم تكن مقيدة بمناطق التوتر والضغط23. لذلك ، اخترنا المنطقة الواقعة داخل ثلاثة جذور من M1 في المقطع العرضي لعظم الفك العلوي كمنطقة الاهتمام (ROI) ووصفنا طرقا لتقييم نشاط بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم في نفس المنطقة لتقييم إعادة تشكيل العظم السنخي تحت OTM.
كعامل نسخ نووي ، ثبت أن محول الإشارة ومنشط النسخ 3 (STAT3) حاسمان في توازن العظام24,25. أفادت الدراسات السابقة عن انخفاض كثافة المعادن في العظام والكسور المرضية المتكررة في الفئران الطافرة Stat3 26,27. أظهرت دراستنا السابقة أن حذف Stat3 في بانيات العظم Osx + تسبب في تشوه قحفي وجهي وهشاشة العظام ، بالإضافة إلى كسر العظام التلقائي28. في الآونة الأخيرة ، قدمنا أدلة في الجسم الحي مع نموذج ماوس حذف Stat3 خاص ببانيات العظم (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/ fl ، المشار إليها فيما يلي Stat3Col1α2ERT2) أن STAT3 أمر بالغ الأهمية في التوسط في تأثيرات قوة تقويم الأسنان التي تقود إعادة تشكيل العظام السنخية29. في هذه الدراسة ، نقدم طرقا وبروتوكولات لاستخدام الفئران الضربة القاضية Stat3 الخاصة بنسب بانيات العظم لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان ووصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء OTM ، وبالتالي إلقاء الضوء على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لأن سوء الإطباق هو من بين أكثر اضطرابات الفم شيوعا التي تضعف التنفس والمضغ والتحدث وحتى المظهر ، فإن الطلب على تقويم الأسنان يتزايد يوما بعد يوم مع ارتفاع معدل الإصابة من 70٪ إلى 93٪ وفقا لمسح وبائي سابق31,32. أصبحت كيفية تسريع إعادة تشكيل العظام السنخية لر…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81870740 ، 82071083 ، 82271006 ، 82101048 ، 81800949) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي (21ZR1436900 ، 22ZR1436700) ؛ برنامج شنغهاي الأكاديمي / قائد أبحاث التكنولوجيا (20XD1422300) ؛ خطة البحوث السريرية ل SHDC (SHDC2020CR4084) ؛ صندوق البحوث متعدد التخصصات لمستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYJC201902 ، JYJC202116) ؛ فريق أبحاث الابتكار للجامعات المحلية رفيعة المستوى في شنغهاي (SSMUZLCX20180501) ؛ صندوق الانضباط البحثي رقم. KQYJXK2020 من مستشفى الشعب التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ، وكلية طب الأسنان ، جامعة شنغهاي جياو تونغ. مشروع الاستكشاف الأصلي لمستشفى شنغهاي الشعبي التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYYC003) ؛ مشروع موهبة مائتي من كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ؛ مشروع البحث التعاوني لمعهد المواد الحيوية والطب التجديدي كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (2022LHB02) ؛ مشروع البنك الحيوي لمستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (YBKB201909 ، YBKB202216).
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
Referencias
- Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
- Frost, H. M. Wolff’s Law and bone’s structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
- Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
- Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
- Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
- Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
- Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
- Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
- Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
- Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
- Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
- Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
- Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
- Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
- Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
- Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
- Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
- Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
- Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
- Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
- Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
- Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
- Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
- van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
- Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
- Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
- Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
- Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
- Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
- Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
- Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
- Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).
