Summary
Det eksperimentelle design, der præsenteres her, giver en nyttig reproduktionsmodel til undersøgelser af antigenspecifikke CD8 + T-celler under lymfeknudemetastase (LN), hvilket udelukker forstyrrelse af tilskuer-CD8 + T-celler.
Abstract
Tumorantigenspecifikke CD8 + T-celler fra dræning af lymfeknuder får en akkumulerende betydning ved montering af antitumorimmunrespons under tumorgenese. Imidlertid danner kræftceller i mange tilfælde metastatiske loci i lymfeknuder, før de yderligere metastaserer til fjerne organer. I hvilket omfang de lokale og systematiske CD8 + T-celleresponser blev påvirket af LN-metastaser forbliver uklart. Til dette formål opsatte vi en murin LN-metastasemodel kombineret med en B16F10-GP melanomcellelinje, der udtrykker surrogatneoantigenet afledt af lymfocytisk choriomeningitisvirus (LCMV), glycoprotein (GP) og P14 transgene mus, der huser T-cellereceptorer (TCR'er), der er specifikke for GP-afledt peptid GP33-41 præsenteret af klasse I major histocompatibility complex (MHC) molekylet H-2Db. Denne protokol muliggør undersøgelse af antigenspecifikke CD8+ T-celleresponser under LN-metastase. I denne protokol blev C57BL/6J-mus subkutant implanteret med B16F10-GP-celler efterfulgt af adoptivoverførsel med naive P14-celler. Når den subkutane tumor voksede til ca. 5 mm i diameter, blev den primære tumor udskåret, og B16F10-GP-celler blev direkte injiceret i tumordrænende lymfeknude (TdLN). Derefter blev dynamikken i CD8 + T-celler overvåget under processen med LN-metastase. Samlet set har denne model givet en tilgang til præcist at undersøge de antigenspecifikke CD8 + T-celleimmunresponser under LN-metastase.
Introduction
Cancer immunterapi, især immuncheckpoint blokade (ICB), har revolutioneret kræftbehandling1. ICB blokerer de coinhibitory immunreceptorer (såsom PD-1, Tim-3, LAG-3 og TIGIT), som er stærkt udtrykt i udmattede CD8 + T-celler i tumormikromiljøet (TME), hvilket fører til genoplivning af udmattede CD8 + T-celler2. I betragtning af heterogeniteten af udmattede CD8 + T-celler afslørede akkumulerende beviser, at tumorspecifikke CD8 + T-celler afledt af periferien, herunder dræning af lymfeknude (dLN), men ikke i TME, medierer effekten af ICB 3,4,5,6,7,8. For nylig blev TdLN-afledte TCF-1 + TOX- tumorspecifikke hukommelses-CD8 + T-celler (TdLN-TTSM) bekræftet at være de ægte respondenter på ICB, som legemliggør flere funktionelle egenskaber ved konventionelle hukommelses-T-celler og yderligere kunne udvide og differentiere sig til afkomsudmattede celler ved ICB-behandling9. Alt i alt bekræftede disse resultater betydningen af LN i montering af antitumorimmunitet.
Lymfeknude fungerer som et kritisk sted for at lette priming og aktivering af tumorspecifikke CD8 + T-celler ved at tilvejebringe strukturelt grundlag såvel som biologiske signaler10. Flere typer kræftceller frø ofte sentinel lymfeknude (SLN, den første LN, der dræner en primær tumor) før systematisk spredning11. Tilstedeværelsen af SLN-metastaser er forbundet med dårligt resultat i human kræft, og prækliniske modeller viste, at tumorceller i TdLN kunne sprede sig til fjerne organer gennem både lymfekarrene og blodkarrene i knuden 12,13,14,15. SLN-biopsi repræsenterer nu en standardprocedure til vejledning af efterfølgende behandlingsbeslutninger i mange solide tumortyper, som kunne undgå unødvendig resektion af uinvolveret LN16,17. Selv for den involverede LN forbliver det kontroversielt, om og hvornår kirurgisk resektion er nødvendig, da flere undersøgelser har vist, at fjernelsen af regional LN ikke udviste forbedret samlet overlevelse sammenlignet med dem, der modtog stråling eller systemisk terapi uden regional LN-resektion 18,19. En fortolkning er, at metastatisk LN (mLN) med mikroskopisk sygdom kan bevare en vis kapacitet til at uddanne immunceller og give nogle terapeutiske fordele. Så det er kritisk vigtigt at belyse, hvordan LN-metastase påvirker antitumorimmunresponset, især egenskaberne og funktionerne af TdLN-TTSM.
Indtil nu har både prækliniske og kliniske data afsløret nogle strukturelle og cellulære ændringer i mLN20. Imidlertid er de dynamiske ændringer af tumorspecifikke CD8 + T-celler under LN-metastase ikke blevet afgrænset. Derfor er det nødvendigt at udvikle en overbevisende model af LN-metastase til yderligere undersøgelse. Faktisk har flere undersøgelser rapporteret mLN musemodeller på forskellige måder 14,21,22. For eksempel blev spontan metastase i aksillære LN'er udført gennem implantation af 4T1 brystkræftceller i brystfedtpuden22. I en anden undersøgelse genererede Reticker-Flynn et al. melanomcellelinjer med høj forekomst af spredning fra subkutan primær tumor til LN'er gennem seriel podning af tumorceller dyrket fra dissocieret mLN-væv (ni runder)14. En anden almindeligt anvendt model blev fremstillet ved injektion af tumorceller i fodpuden, og de metastatiske loci ville blive dannet i popliteal LN22. Især er det vanskeligt at evaluere de præcise tidspunkter for intervention, fordi LN-metastaser i disse modeller ikke altid er trofaste.
I denne undersøgelse blev en murine LN metastatisk model etableret gennem intranodal injektion af B16F10-GP-celler23,24, genereret ved CRISPR / Cas9-medieret indsættelse af LCMV-virusglycoprotein (GP) gensekvens i genomet af B16F10-cellelinje9. Derefter blev disse mus overført med P14-celler, der huser transgene T-cellereceptorer (TCR'er), genkender specifikt H-2Db GP33-41 epitop25,26, og den systemiske og lokale dynamik af antigenspecifikke CD8 + T-celler under LN-metastase kunne undersøges. Vores eksperimentelle design giver en nyttig model til undersøgelse af immunresponser, især de antigenspecifikke CD8 + T-celler under LN-metastasen, som udelukker forstyrrelse af tilskuere CD8 + T-celler. Disse resultater vil påvirke de kliniske behandlingsmuligheder for, om mLN skal fjernes eller bevares og kaste nyt lys over manipulation af mLN for at opnå maksimale terapeutiske fordele.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De C57BL/6J mus (kaldet B6 mus) og naive P14 transgene mus 9,27 brugte var 6-10 uger gamle, der vejede 18-22 g. Både mand og kvinde blev inkluderet uden randomisering eller blinding. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Qingdao Agricultural University.
1. Fremstilling af substrat og reagenser
- Forbered B16F10-GP melanomcellekulturmedium, navngivet D10 (komplet DMEM-medium) ved at tilføje DMEM, 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin med yderligere 100 U / ml puromycin. Oprethold en steril D10 og opbevar i op til 2 uger ved 2-4 °C.
- Forbered R2-medium (til ophør af røde blodlegemer) ved at tilføje RPMI-1640 med 2% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin.
- Forbered buffer til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) ved at tilsætte 1x fosfatbufret saltvand (PBS) med 2% FBS og 0,01% natriumazid. Tilsætningen af natriumazid kan forlænge opbevaringstiden for FACS-buffer, som kan opbevares i måneder ved 2-4 ° C.
- Forbered buffer til rødblodsanalyse (RBL) ved at tilsætte 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 og 0,1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i dobbeltdestilleret vand og juster pH til 7,3. Opbevar RBL-bufferen ved stuetemperatur (RT), og den forbliver stabil i op til 3 måneder.
- Bedøvelsesmidlet 2,2,2-tribromethanol fremstilles som beskrevet nedenfor.
- Der afvejes en passende mængde 2,2,2-tribromethanolkrystal i et 50 ml sterilt konisk rør ompakket med aluminiumsfolie. Der tilsættes en passende mængde 2-methyl-2-butanol i krystallen for at fremstille stamopløsningen med en koncentration på 500 mg/ml.
- Det hvirvles rundt for at blande og varme tuben op i et 37 °C vandbad, indtil krystallen er opløst. Sørg for, at alle krystaller er opløst.
- Bland opløsningen grundigt. Stamopløsningen filtreres med et 0,22 μm filter i en steril beholder. Stamopløsningen opbevares frossen, afskærmet mod lys, ved -20 °C eller fortyndes med PBS i en arbejdsopløsning i en koncentration på 12,5 mg/ml og opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Det er bedst at bruge den foreskrevne koncentration, da højere koncentrationer af væsken er irriterende.
2. Fremstilling af B16F10-GP cellesuspension
- Optø og dyrk et hætteglas med 1 x 106 B16F10-GP-celler med 5 ml D10 i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO2. Subkulturceller, når de nåede 80% til 90% tæthed som beskrevet nedenfor.
- Kassér det oprindelige dyrkningsmedium ved aspiration med en pipetteringspistol og vask cellerne 2x med PBS. Når du rengør klæbende celler med PBS i en cellekulturskål, skal du flytte PBS til sidevæggen eller slippe den ned i skålen.
- Efter aspiration af PBS tilsættes 0,5-1 ml 0,25% trypsin EDTA-opløsning til cellekulturskålen eller kolben. Ryst forsigtigt for at dække hele celleoverfladen. Cellekulturskålen eller kolben anbringes i en inkubator ved 37 °C i ca. 1 min eller ved RT, indtil cellerne er afrundede og adskilt. Overhold eksfoliering af celler ved hjælp af et omvendt mikroskop.
- Tilsæt lige så meget friskformuleret D10 for at afslutte trypsinfordøjelsen. Den nedre overflade af cellekulturkolben renses med en pipetteringspistol for at sikre, at alle celler blev adskilt.
- Overfør B16F10-GP cellesuspensionen til et 15 ml centrifugeglas og centrifuger ved 163 x g i 4 minutter ved RT.
- Opsug supernatanten og kassér den. Resuspender cellerne i 1-2 ml D10 til nedbør. B16F10-GP-cellesuspension overføres til en ny cellekulturskål eller kolbe indeholdende 8-10 ml D10 og inkuberes derefter i en celleinkubator ved 37 °C ved 5% CO2.
- På dagen for tumorimplantation indsamles B16F10-GP-celler med en densitet på ca. 90% som beskrevet i trin 2.1.1 til 2.1.4. Efter centrifugering aspireres supernatanten og kasseres. Cellebundfaldet resuspenderes i 1 ml PBS.
- Tæl levedygtige celler ved hjælp af et 0,4% trypanblåt hæmocytometer. Der tilsættes PBS for at fortynde cellen til 5 x 105 celler pr. 100 μL. Anbring cellerne på is indtil brug.
3. Ektopisk podning af B16F10-GP-celler i den bilaterale lyskeregion hos mus
- Opsug 100 μL forberedt B16F10-GP cellesuspension ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Svip rørvæggen for at flytte boblerne til toppen, og skub stemplet for at flytte den øverste boble ud.
- Hold musen i liggende stilling og udsæt dens mave. Tryk musens højre bagben i liggende stilling med en finger, så huden i højre lyskeregion er fuldt eksponeret (Samme med venstre lyskeregion).
- Fjern pelsen på maven med hårfjerningscreme, og rengør derefter det bilaterale maveområde med bomuld indeholdende 75% ethanol.
- Før du indsætter nålen, skal du sørge for, at huden i lyskeområdet strammes. Indsæt nålen i en vinkel på 45° i det subkutane rum i lyskeområdet på det øverste lår. Sørg for, at nålen er skrå opad og nålens dybde til 0,5-1 cm.
- Påfør forsigtigt sugning før injektion, hvis der ikke er blod, injicer cellerne langsomt injiceret i det subkutane væv. På samme tid observeres en lille bolus (dannelse af væskelomme) i det subkutane område.
- Efter injektion skal du fjerne nålen, læg den i skarpkassen og returnere musen til buret.
4. Adoptiv overførsel af P14 T-celler til tumorbærende mus
- Udfør adoptivoverførsel i tumorbærende mus 6-8 dage efter tumorimplantation, når tumorerne er håndgribelige (ca. 3-5 mm i diameter). Intraperitonealt injiceres 4 mg cyclophosphamid dagen før overførsel 28,29,30.
BEMÆRK: Formålet med CTX-injektion er at skabe plads i lymferummet til adoptivt overførte T-celler ved forbigående eliminering af prolifererende lymfocytter. - Isoler lymfocytter fra milt og LN'er hos naive P14 transgene mus som beskrevet nedenfor31,32 (6-10 uger gamle, samme køn som tumorbærende mus for at undgå afstødningsproblemer).
BEMÆRK: Udfør følgende procedurer i et biosikkerhedsskab for at sikre strengt sterile forhold.- Tilbered to 6 cm skåle, og tilsæt 3 ml R2-medium til en af skålene og 3 ml RBL-buffer til den anden skål. Anbring et 70 μm cellefilter i petriskålen, der indeholder RBL-buffer.
- Aflive P14-mus i lufttætte beholdere indeholdende isofluran efterfulgt af cervikal dislokation. Juster antallet af P14-mus i henhold til antallet af modtagermus.
- Høst milt, lyskelymfeknuder og aksillære lymfeknuder fra de aflivede mus og overfør dem til 6 cm skåle indeholdende 4 ml R2-medium og lagt på is.
- Placer milten i en sil gennemvædet med 3 ml RBL-buffer, slib milten med putteren inde i 1 ml sprøjten. Inkuber cellerne ved RT i 1-2 minutter, og afslut derefter reaktionen med 3 ml koldt R2-medium.
- Slib LN'erne med putteren inde i 1 ml sprøjten, indtil der kun er bindevæv tilbage i sien med et 70 μm cellefilter. Skyl filteret med koldt R2-medium, og overfør cellesuspensionen til et nyt 15 ml centrifugeglas. Prøverne centrifugeres ved 500 x g i 6 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes med 3 ml PBS. Brug et 70 μm cellefilter til at fjerne flokkulent materiale fra cellesuspensionen.
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 500 x g i 6 minutter ved 4 °C. Resuspender cellerne med 3 ml PBS og læg røret på is. Tag en lille prøve, bland med trypanblå, og tæl celler ved hjælp af en blodcelletælleplade.
- Bestem procentdelen af P14-celler (levende/død-CD45.1+CD8+Vα2+) ved flowcytometri. Sørg for, at de overførte donorceller udviser tydelig kongen markør med modtagermus (tumorbærende B6-mus er CD45.2+). Udfør farvning før overførsel for at verificere den korrekte fænotype af de overførte celler.
- Der tilsættes 5 x 104-1 x 105 celler til et 1,5 ml centrifugerør indeholdende 1 ml FACS-buffer. Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g ved 4 °C i 3 minutter.
- Supernatanten kasseres, svirp med bunden af røret for at sprede cellerne, og læg tuben på is.
- Følgende konjugerede antistofblanding 9,32 fortyndes i 100 μL FACS-buffer: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Levende/død plet, 1:400. (Tabel over materialer).
- Antistofblandingen centrifugeres ved 15.000 x g i 3 minutter for at samle partiklerne. Placer blandingen på is og beskyt den mod lys ved at pakke den ind i folie. Tag kun supernatanten for at undgå aspiration af partikler.
- Resuspender cellerne i 100 μL af antistofblandingen og bland grundigt ved at svirpe rørvæggen. Efter indpakning i stanniol inkuberes røret i 30 minutter på is.
- Vask cellerne 2x med FACS-buffer. Centrifuger glasset ved 500 x g ved 4 °C i 3 min. Resuspender cellerne med 200 μL FACS-buffer, og overfør cellesuspensionen til et flowrør.
- Kør flowrøret med farvede celler på et flowcytometer for at bestemme procentdelen af levende/døde CD45,1+CD8+Vα2+ celler.
BEMÆRK: Generelt indeholdt over 90% af CD8 + T-celler fra P14 transgene mus Vα2 + TCR'er, som er specifikke for H-2Db GP33-41 epitop af LCMV (lymfocytisk choriomeningitisvirus).
- Beregn det absolutte antal levende/døde CD45.1+CD8+Vα2+ -celler ved at gange procentdelen og det aktive celletal opnået i trin 4.2 og 4.3.
- Opsug 200 μL P14-cellesuspension (5 x 105 celler) med en 100 E insulinsprøjte og fjern bobler. Det oprindelige antal overførte naive P14-celler (5 x 103 - 5 x 105) påvirkede ikke fænotypen af overførte celler9.
- Placer musene i et bur og varm med en infrarød lampe i 5-10 minutter for at udvide halevenen. Hold på plads med en musefiksator i passende størrelse, ret halen og tør den af med en bomuldskugle, der indeholder 75% ethanol for at gøre venerne synlige.
- Indsæt nålen parallelt med halevenen og træk forsigtigt stemplet tilbage. Hvis der strømmer blod ind i sprøjten, skal du langsomt skubbe cellesuspensionen ind i venen.
BEMÆRK: Hvis der er modstand eller hævelse af halen under injektionen, skal injektionspositionen justeres. Injektionsstedet skal starte i den distale ende. - Når injektionen er afsluttet, trækkes kanylen hurtigt ud, og trykket forsigtigt på injektionsstedet med en vatrondel. Sæt musen tilbage i et nyt rent bur og observer det nøje i flere minutter for eventuelle bivirkninger.
5. Resektion af den primære tumor
BEMÆRK: Sørg for, at alle kirurgiske instrumenter er autoklaveret før brug. Steriliser operationsområdet inde i biosikkerhedsskabet med 75% ethanol efterfulgt af UV-bestråling i mindst 30 minutter. Brug rene kjoler, hatte, masker og sterile handsker under operationen.
- Når tumoren er håndgribelig (ca. 5 mm i diameter), resekteres den primære tumor.
- Bedøv musene med intraperitoneal injektion af ketamin (75 mg / kg). Klem fodpude for at evaluere graden af anæstesi, hvis der ikke er nogen smerterefleks, angiver det den rigtige timing for operationen. Hvis bagbenene blev trukket tilbage, skal du give en anden dosis på 10-30 μL.
BEMÆRK: Alternativt intraperitoneal medetomidin (1 mg/kg legemsvægt; Domitor) anbefales at bedøve mus. - Påfør den tørreforebyggende salve på musens øjne. Fjern pelsen på maven med hårfjerningscreme for fuldt ud at udsætte det kirurgiske felt.
- Placer musen i et biosikkerhedsskab og læg den på et anatomisk bord dækket med rent absorberende papir i liggende stilling, så musens længdeakse er parallel med eksperimentatoren.
BEMÆRK: For at opretholde et strengt sterilt miljø skal følgende procedurer udføres i et biosikkerhedsskab. - Desinficere musenes underliv med en bomuldskugle gennemblødt i povidon-jod. Skær huden nær det tumorbærende sted med en steril skalpel eller optalmisk saks. Indsæt lukket saks tip i snittet for tydeligt at udsætte tumoren. Når du skærer huden, skal du sørge for ikke at beskadige de indinale lymfeknuder.
- Under tumorfjernelse skal kapslen holdes så intakt som muligt. Fjern forsigtigt og forsigtigt bindevævet ved siden af tumoren med steril saks. Fjern tumoren in situ helt, ellers kan det gentage sig.
6. Intranodal injektion af B16F10-GP-celler i den indinale lymfeknude
BEMÆRK: Efter bilateral tumorclearance blev B16F10-GP-celler injiceret i ensidig lyskelymfeknude, og PBS blev injiceret i den anden side.
- Aspirat 20 μL (5 x 104 celler) B16F10-GP cellesuspension med en 100 E insulinsprøjte, fjern bobler og injicer derefter i en lyskelymfeknude. Injicer et lige så stort volumen PBS i den indinale lymfeknude på den anden side.
- Indsæt nålen fra den distale ende af lymfeknuden under injektionen, og indsæt derefter langsomt nålen til midten af lymfeknuden. På dette tidspunkt, hvis væsken injiceres nøjagtigt i lymfeknuden, kan lymfeknuden ses at svulme betydeligt.
BEMÆRK: Når nålen indsættes fra den distale ende af lymfeknuden, skal du sørge for ikke at punktere knuden.
- Indsæt nålen fra den distale ende af lymfeknuden under injektionen, og indsæt derefter langsomt nålen til midten af lymfeknuden. På dette tidspunkt, hvis væsken injiceres nøjagtigt i lymfeknuden, kan lymfeknuden ses at svulme betydeligt.
- Sutur snittet med 2-3 sting ved hjælp af en 3-0 sutur. Desinficere huden omkring såret med bomuld imprægneret med povidon jod. Pas på at omgå lymfeknuder under suturering.
- Placer musen i et rent bur og hold varmen ved hjælp af infrarødt lys i lateral decubitus position. Overvåg kontinuerligt, indtil bevidstheden er genoprettet. Sørg for, at de mus, der har gennemgået operation, ikke returneres til andre dyrs selskab, før de er fuldt genoprettet.
- Giv buprenorphin hver 4-6 timer i 3 på hinanden følgende dage efter operationen for at lindre postoperative smerter (i en dosis på 0,1-0,5 mg/kg, SQ eller IP). Overvåg musenes fodrings-, drikke-, bevægelses- og aktivitetsområder. Typisk kommer mus sig efter kirurgisk traume inden for 3 dage.
BEMÆRK: Hvis mus ikke er i stand til at genoptage normal fodring og aktiviteter og viser tegn på infektion, skal du konsultere en dyrlæge for intervention eller aflive det. - Ofre mus på forskellige tidspunkter: dag 8 og dag 18 efter intranodal injektion af tumorceller. Gendan aktiverede donorceller ved hjælp af flowcytometrianalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det skematiske diagram over dette eksperimentelle design er vist i figur 1A. I alt 5 x 105 B16F10-GP-celler i 100 μL PBS blev subkutant (s.c.) implanteret i den bilaterale lyskeregion af CD45.2 C57BL/6J-mus. Efter 7 dage blev disse tumorbærende mus intraperitonealt (i.p.) injiceret med 4 mg CTX efterfulgt af adoptiv overførsel af 5 x 105 CD45.1+P14 celler gennem intravenøs (i.v.) haleinjektion. Når tumorer voksede til ca. 3-5 mm i diameter (ca. 7 dage efter P14-celleoverførsel), blev primære tumorer resekteret, og 5 x 104 B16F10-GP-celler i 20 μL PBS blev direkte injiceret i ensidig lyskelymfeknude. Den indinale lymfeknude på den anden side blev injiceret med lige store mængder PBS. Repræsentativ hæmatoxylin og eosin (H&E, 100x) farvning af den ikke-metastatiske lymfeknude (nLN) og metastatiske lymfeknude (mLN) på angivne tidspunkter er vist i figur 1B. Strukturen af nLN var intakt. I det tidlige stadium af LN-metastase (D8) var mLN delvist optaget af tumorceller (sort pil), og der er stadig noget resterende område med lymfocytter, der ikke er blevet invaderet af tumorceller (rød pil). Mens i det sene stadium af LN-metastase (D18) er mLN fyldt med tumorceller ledsaget af tumorangiogenese og små lymfocytter. Aktiverede P14-celler genvundet i TdLN producerede højt niveau af IFN-γ efter GP33-41 peptidstimulering 9,31. Her blev procentdelene af aktiverede P14-celler analyseret gennem flowcytometri på forskellige tidspunkter, og gating-strategien er vist i figur 2. Hyppigheden af antigenspecifikke CD8+ T-celler i perifert blod i det tidlige stadium (D8) og det sene stadium (D18) er henholdsvis 2,81% og 1,48% (figur 3A). Tumorspecifikke CD8 + T-celler er blevet rapporteret at opholde sig strengt i dLN under tumorigenese og ikke-drænende LN genvundne begrænsede donorceller33. Procentdelen af antigenspecifikke P14-celler i nLN var stabil under LN-metastase. Interessant nok blev antigenspecifikke CD8 + T-celler i mLN forbigående boostet i det tidlige stadium, hvilket fremgår af den højere frekvens af P14-celler sammenlignet med nLN, mens den faldt kraftigt i det sene stadium (figur 3B).
Figur 1: Skematisk diagram over det eksperimentelle design. (A) C57BL/6J-mus (CD45.2+) implanteres med 5 x 105 B16F10-GP tumorceller på den bilaterale lyskeregion. Efter 7 dage injiceres disse mus intraperitonealt med 4 mg CTX og efterfølges af adoptiv overførsel af forskellige kongenisk markerede (CD45.1+) P14-celler den næste dag. Når tumorer vokser til ca. 3-5 mm i diameter (ca. 7 dage efter P14-celleoverførsel), resekteres primære tumorer, derefter injiceres 5 x 104 B16F10-GP-celler i 20 μL PBS direkte i ensidig lyskelymfeknude, og den indinale lymfeknude på den anden side injiceres med lige store mængder PBS. (B) Repræsentativ hæmatoxylin og eosin (H&E,100x) farvning af LN'erne. Forkortelser: s.c. = subkutan; CTX= cyclophosphamid i.v. = intravenøs; Sac = offer; nLN = ikke-metastatisk LN; mLN = metastatisk LN. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gating strategi for flow cytometri analyse. Gating strategi bruges til at identificere donorafledte aktiverede antigenspecifikke CD8 + T-celler. Forkortelser: L/D = levende/død. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dynamik af antigenspecifikke CD8+ T-celler under LN-metastase. Andelen af antigenspecifikke CD8+ T-celler i (A) perifert blod, (B) nLN og mLN på forskellige tidspunkter. Forkortelser: nLN = ikke-metastatisk LN; mLN = metastatisk LN. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under tumorgenese opsluger antigenpræsenterende celler (APC'er) tumorantigener og migrerer til TdLN, hvor de primer CD8 + T-celler. Efter priming og aktivering forlader CD8 + T-celler TdLN og infiltrerer tumoren for at dræbe tumorceller10. Gennem TdLN-resektion og administration af FTY720, som blokerer immuncellernes udgang fra lymfeorganerne, har flere undersøgelser vist TdLN's afgørende rolle i at sikre effekten af PD-1/PD-L1 checkpoint-terapi34,35. I overensstemmelse med dette fandt vi for nylig, at tumorspecifikke hukommelses CD8 + T-celler (TTSM) overvejende befinder sig i TdLN, disse TdLN-TTSM-celler tjener som bona fide responders til ICB9. Desværre spredes flere typer kræftceller ofte til TdLN'er fra primære tumorsteder, hvilket fører til strukturel bekræftelse og immuncelledysfunktion i TdLN'er. Den forringede mængde og kvalitet af CD8 + T-celler i mLN'er er allerede beskrevet20,36. Imidlertid er de dynamiske ændringer af CD8 + T-celler, især de tumorantigenspecifikke CD8 + T-celler under LN metastatisk kaskade, ikke blevet belyst.
Her udviklede vi en praktisk musemodel til overvågning af dynamikken i systemiske og lokale antigenspecifikke CD8+ T-celler under processen med LN-metastaser. B16F10-GP melanomceller blev subkutant implanteret i den bilaterale lyskeregion, efterfulgt af adoptiv overførsel med P14-celler, som specifikt kunne aktiveres af det GP-afledte peptid GP33-41. På dag 7 efter celleoverførsel, når P14-celler i inguinale LN'er var fuldt aktiveret, blev primære tumorer i begge sider resekteret, og B16F10-GP-celler blev injiceret direkte i ensidig lyske-LN, blev skinoperation på den anden side udført gennem injektionen med lige store mængder PBS. Dette geniale design gør det muligt at sammenligne P14-celler i mLN og ikke-metastatisk LN (nLN) inden for de samme mus. Samtidig blev P14-celler i perifert blod inden for de samme mus detekteret på forskellige tidspunkter under LN-metastase ved blødning af orbitalvenen. Bortset fra frekvenserne af P14-celler i perifert blod og TdLN'er på forskellige stadier under LN-metastase, kunne de transkriptionelle og epigenetiske egenskaber af disse antigenspecifikke CD8 + T-celler undersøges yderligere med andre teknikker.
Bemærk, at flere trin skal udføres forsigtigt. For det første skal de primære tumorer udskæres grundigt, da de resterende tumorceller hurtigt vil vokse igen. For det andet skal operationen udføres forsigtigt, da tumorvæv indeholder rigelige nye blodkar, som normalt uundgåeligt brydes under primær tumorresektion og fører til kirurgiske mus' død på grund af massiv blødning. Derfor er tidspunktet for primær tumorresektion kritisk vigtigt. Generelt er det relativt sikkert at fjerne det, når tumoren vokser til størrelsen ca. 5 x 5 mm, og tumorceller skal injiceres præcist i LN snarere end bunden eller tilstødende væv. Desuden bør mængden af tumorcellesuspensioner kontrolleres under 20 μL, ellers ville spild danne ny tumor uden for LN. Endelig er en begrænsning af denne protokol, at operationen er traumatisk, og mus kan opleve infektion under helingsprocessen, hvilket ville påvirke egenskaberne af antigenspecifikke CD8 + T-celler. Derfor er det kritisk vigtigt at opretholde streng asepsis under operationen, og sham-opereret PBS-injektion bør udføres for at udelukke virkningen af injektionsinduceret fysisk skade på de antigenspecifikke CD8 + T-celler.
Samlet set leverer vi en praktisk model til at undersøge de antigenspecifikke CD8 + T-celler under LN-metastase, og interaktionerne mellem antigenspecifikke CD8 + T-celler og andre immunceller eller stromaceller under LN-metastase kunne også belyses. Derudover kunne det let udvides til flere andre tumormodeller. Samlet set tilbyder denne protokol en nyttig reproduktionsmodel til undersøgelse af kræftimmunologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr. 82122028 til LX), National Natural Science Foundation of China (nr. 82173094 til LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr. 2023NSCQ-BHX0087 til SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
