מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב לאפיון מבני עמילואיד ללא תוויות

Summary

מאמר זה מתאר כיצד ניתן ליישם מיקרוסקופ דו-פוטוני רגיש לקיטוב כדי לאפיין את הארגון המקומי בתוך מבני-על-עמילואיד-ספרוליטים נטולי תוויות. הוא גם מתאר כיצד להכין ולמדוד את הדגימה, להרכיב את ההתקנה הנדרשת, ולנתח את הנתונים כדי לקבל מידע על הארגון המקומי של סיבי עמילואיד.

Abstract

בהשוואה למקבילו בעל פוטון אחד, עירור של שני פוטונים מועיל לניסויי הדמיה ביולוגית בגלל רעילות האור הנמוכה שלו, חדירה עמוקה יותר של רקמות, פעולה יעילה במערכות צפופות ובחירת אור זוויתית מופחתת של פלואורופורים. לפיכך, הכנסת ניתוח קיטוב במיקרוסקופ פלואורסצנטי של שני פוטונים (2PFM) מספקת קביעה מדויקת יותר של הארגון המולקולרי בדגימה בהשוואה לשיטות הדמיה סטנדרטיות המבוססות על תהליכים אופטיים ליניאריים. בעבודה זו אנו מתמקדים ב-2PFM (ps-2PFM) הרגיש לקיטוב ויישומו בקביעת הסדר המולקולרי בתוך ביו-מבנים מורכבים-עמילואיד ספרוליטים. מחלות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר או פרקינסון מאובחנות לעתים קרובות באמצעות זיהוי של אגרגטים עמילואידים-חלבונים שנוצרו עקב תהליך קיפול שגוי של חלבון. חקירת המבנה שלהם מובילה להבנה טובה יותר של מסלול היצירה שלהם וכתוצאה מכך, לפיתוח שיטות אבחון רגישות יותר. מאמר זה מציג את ps-2PFM המותאם לקביעת סדר פיבריל מקומי בתוך ספרוליטים של אינסולין בקר וצברי חלבונים עמילואידוגניים כדוריים. יתר על כן, אנו מוכיחים כי הטכניקה המוצעת יכולה לפתור את הארגון התלת ממדי של סיבים בתוך הספרוליט.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, למרות שחלה התפתחות משמעותית של טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות רבות לדימות ביולוגי של חלבונים וצברים שלהם¹, רק מעטים שימשו כדי לפתור את הסדר המקומי שלהם בתוך הדגימה ^2,3. מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי⁴ שימש לחקר ההטרוגניות המבנית הפנימית של מבני-על עמילואידים-ספרוליטים. יתר על כן, קביעה כמותית של הסדר המקומי בתוך מבנים ביולוגיים מורכבים וצפופים כגון ספרוליטים יכולה להיפתר באמצעות שיטות רגישות לקיטוב³. עם זאת, טכניקות פלואורסצנטיות סטנדרטיות עם חדירה שטחית לרקמות מוגבלות מכיוון ששימוש באורכי גל UV-VIS כדי לעורר פלואורופורים in vivo מוביל לפיזור אור רקמה גבוה⁵. בנוסף, הדמיה כזו דורשת לעתים קרובות תכנון וקשירה של גשושיות פלואורסצנטיות ספציפיות לביומולקולה ממוקדת, ובכך מגדילה את העלות ואת כמות העבודה הדרושה לביצוע הדמיה.

לאחרונה, כדי לטפל בבעיות אלה, הצוות שלנו התאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעורר שני פוטונים רגישים לקיטוב (ps-2PFM) להדמיה ללא תוויות של מבנים ביולוגיים ^6,7. Ps-2PFM מאפשר למדוד את התלות של עוצמת פלואורסצנטיות של שני פוטונים בכיוון הקיטוב הליניארי של קרן העירור וניתוח הקיטוב של הפלואורסצנטיות הנפלטת⁸. היישום של שיטה זו דורש תוספת של נתיב עירור סטנדרטי של מערך מיקרוסקופ רב-פוטונים (איור 1) עם לוח חצי גל כדי לשלוט במישור קיטוב האור. לאחר מכן, גרפים קוטביים, המתארים את התלות של עוצמת פלואורסצנטיות מעוררת של שני פוטונים בקיטוב של קרן לייזר העירור, נוצרים מאותות שנאספו על ידי שתי פוטודיודות מפולת שלגים, ובכך אוספים את שני המרכיבים המאונכים זה לזה של קיטוב פלואורסצנטי.

השלב האחרון הוא תהליך ניתוח הנתונים, תוך התחשבות בהשפעת האלמנטים האופטיים, כגון מראות דיכרואיות או יעד צמצם מספרי גבוה, על הקיטוב. בגלל אופיו של תהליך שני פוטונים, שיטה זו מספקת הן בחירת צילום זוויתית מופחתת והן רזולוציה צירית משופרת, שכן עירור שני פוטונים של פלואורופורים מחוץ למישור המוקד מוגבל מבחינה הסתברותית. כמו כן הוכח כי שיטות דומות יכולות להיות מיושמות בהצלחה עבור הדמיה in vivo של בדיקות אינפרא אדום קרוב (NIR) עבור דימות רקמות עמוקות⁹. Ps-2PFM יושם בעבר על פלואורופורים של תמונות בקרומי תאים¹⁰ ו-DNA^11,12, כמו גם על סמנים פלואורסצנטיים לא סטנדרטיים של מערכות ביולוגיות, כגון ננו-חלקיקי זהב¹³. עם זאת, בכל הדוגמאות הללו, המידע על ארגון הביומולקולות התקבל בעקיפין ודרש אוריינטציה הדדית מוגדרת מראש בין פלואורופור לביומולקולה.

באחד המאמרים האחרונים שלנו, הראינו כי ps-2PFM יכול להיות מיושם בהצלחה לקביעת הקיטוב המקומי של אוטופלואורסצנטיות של מבני על עמילואיד ופלואורסנציה מתיופלבין T, צבע ספציפי לעמילואיד, הקשור לסיבי עמילואיד בספרוליטים⁶. יתר על כן, במקרה אחר, הוכחנו כי ps-2PFM יכול לשמש כדי לזהות כיוון פיבריל עמילואיד בתוך ספרוליטים עמילואיד במשטר גודל תת-מיקרון, אשר אושר על ידי קורלציה עם דימות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)⁷. ההישג של תוצאה זו התאפשר הודות ל-i) אוטופלואורסנציה פנימית של ספרוליטים-עמילואידים, כאשר הם מעוררים עם פוטון אחד או שניים, מציגים אוטופלואורסצנטיות פנימית עם מקסימום פליטה הממוקם בטווח שבין 450 ל-500 ננומטר ושני חתכי בליעה של שני פוטונים הדומים לצבעים פלואורסצנטיים סטנדרטיים¹⁴, ii) מודלים מתמטיים שהוצגו בעבר כדי לתאר כיצד ps-2PEF של צבעים המסמנים קרומים ביולוגיים ומבני DNA יכולים להיות מיושמים על פלואורסצנטיות המוצגת על ידי ספרוליטים וצבעים הקשורים אליהם ^8,11,15. לכן, לפני שנמשיך בניתוח, אנו ממליצים בחום לעבור על התיאוריה הנדרשת המתוארת בשניהם, הטקסט העיקרי והמידע התומך של המאמר הראשון שלנו בנושא^{זה 6}. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול כיצד ליישם את טכניקת ps-2PFM עבור אפיון מבני עמילואיד ללא תווית של ספרוליטים של אינסולין בקר.

Protocol

1. הכנת שקופיות המיקרוסקופ עם ספרוליטים מגודלים במלואם הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. כל התמיסות הוכנו עם מים נטולי יונים, (18.2 MΩ·cm ב-25°C) שהתקבלו ממערכת טיהור המים. לדגור על הספרוליטים העמילו?…

Representative Results

הפרוטוקול המוצג מספק הדרכה שלב אחר שלב באמצעות הכנת מבני על עמילואידיים לבדיקה עם ps-2PFM, בניית המערכת המיקרוסקופית ומדידות של הדגימה המתאימה. אולם לפני סדרת המדידות הסופית, חיוני ליישר כראוי את ה-APDs עם ייחוס איזוטרופי, מה שאמור לגרום לאיסוף אות סימטרי בעל צורה ועוצמה דומות בשני הגלאים (<strong …

Discussion

מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב הוא כלי רב ערך לחקר הסדר המקומי של סיבים בתוך מבני העל של עמילואיד, הדורש רק שינויים קטנים של מערך המולטיפוטונים הסטנדרטי. מכיוון שהוא פועל על תופעות אופטיות לא ליניאריות, ניתן להשיג בחירת צילום זוויתית מופחתת ורזולוציה צירית משופרת בהשוואה לשיטות מיקרו?…

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5