Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Summary

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Abstract

Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas que se han utilizado ampliamente en medicina regenerativa. Dado que las MSC derivadas de tejidos somáticos están restringidas por la donación limitada, las variaciones de calidad y la bioseguridad, en los últimos 10 años se ha visto un gran aumento en los esfuerzos para generar MSC a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Los esfuerzos pasados y recientes en la diferenciación de las hiPSC en MSC se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EB) y (2) el uso del cultivo monocapa. Este protocolo describe estos dos métodos representativos para derivar MSC a partir de hiPSC. Cada método presenta sus ventajas y desventajas, incluyendo el tiempo, el costo, la capacidad de proliferación celular, la expresión de marcadores MSC y su capacidad de diferenciación in vitro. Este protocolo demuestra que ambos métodos pueden derivar MSC maduras y funcionales a partir de hiPSC. El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil, mientras que el método EB se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Introduction

Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas derivadas del^{mesodermo 1}. Las MSC están presentes en casi todos los tejidos conectivos². Desde que las MSC fueron descubiertas por primera vez en la década de 1970 y aisladas con éxito de la médula ósea en 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, se ha utilizado una variedad de tejidos somáticos humanos (incluidos fetales y adultos) para aislar MSC como hueso, cartílago, tendón, músculo, tejido adiposo y estroma de soporte hematopoyético ^1,2,6,7. Las MSC demuestran una alta capacidad proliferativa y plasticidad para diferenciarse en muchos linajes de células somáticas y podrían migrar a tejidos lesionados e inflamados ^2,8,9. Estas propiedades hacen de las MSC un candidato potencial para la medicina regenerativa¹⁰. Sin embargo, las MSC derivadas de tejido somático (st-MSC) están restringidas por la donación limitada, la capacidad proliferativa celular limitada, las variaciones de calidad y la preocupación por la bioseguridad para la posible transmisión de patógenos, si los hubiera, de los donantes^11,12.

Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) se derivan de la reprogramación de células adultas con factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc), que tienen funciones similares a las de las células madre embrionarias^13,14. Pueden autorrenovarse y poseer el potencial de diferenciarse en cualquier tipo de células somáticas, incluidas las MSC. En comparación con las st-MSC, las iPSC-MSC tienen la ventaja de un suministro ilimitado, menor costo, mayor pureza, conveniencia en el control de calidad, fácil producción a escala y modificación genética 15,16,17.

Debido a estas ventajas de las iPSC-MSC, se han reportado una variedad de métodos que impulsan las MSC a partir de iPSC. Estos métodos de diferenciación se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EBs) y (2) el uso de cultivos monocapa 11,18,19,20. En este trabajo se caracterizó un enfoque representativo para cada una de las dos metodologías. Además, se accedió a comparaciones entre dos enfoques representativos basados en el tiempo, el costo, la capacidad proliferativa, la expresión de biomarcadores de MSC y la capacidad de diferenciación in vitro.

Protocol

1. Mantenimiento de hiPSCs Descongelación de hiPSCSaque las células del nitrógeno líquido y descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C. Transfiera las células de descongelación a un tubo de 15 mL preparado con 3 mL de medio de mantenimiento iPSC (Tabla de Materiales). Mezcle suavemente el medio. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células en 1 ml de medio de man…

Representative Results

Siguiendo el protocolo (Figura 1A), las hiPSC se diferenciaron en MSC mediante los métodos de formación de EB y cultivo monocapa. Durante la diferenciación, las células mostraron diferentes morfologías representativas (Figura 1B,C). Como se muestra en la Figura 1B, las colonias de hiPSCs muestran una morfología compacta típica antes de la diferenciación con un borde claro compuest…

Discussion

En este protocolo, se examinaron dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Ambos métodos fueron capaces de derivar MSCs a partir de hi…

Materials

Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100