Injeção Intratecal de Camundongos Recém-Nascidos para Edição do Genoma e Liberação de Fármacos
Summary
O presente protocolo descreve instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em camundongos neonatais para edição gênica e liberação de drogas.
Abstract
A injeção intratecal é um procedimento comumente empregado em clínicas pediátricas e de adultos, servindo como um meio eficaz para administrar medicamentos e tratamentos. Ao administrar diretamente medicamentos e tratamentos no líquido cefalorraquidiano do sistema nervoso central, esse método alcança maiores concentrações localizadas de drogas enquanto reduz os efeitos colaterais sistêmicos em comparação com outras vias, como injeções intravenosas, subcutâneas ou intramusculares. Sua importância vai além dos cenários clínicos, já que a injeção intratecal desempenha um papel vital em estudos pré-clínicos focados no tratamento de distúrbios neurogenéticos em roedores e outros animais de grande porte, incluindo primatas não humanos. No entanto, apesar de sua ampla aplicação, a injeção intratecal em filhotes jovens, particularmente neonatais, apresenta desafios técnicos significativos devido ao seu pequeno tamanho e natureza frágil. A administração bem-sucedida e confiável de injeções intratecais em camundongos recém-nascidos requer atenção meticulosa aos detalhes e consideração cuidadosa de vários fatores. Assim, há uma necessidade crucial de um protocolo padronizado que não apenas forneça instruções, mas também destaque as principais considerações técnicas e boas práticas de laboratório para garantir a consistência do procedimento, bem como a segurança e o bem-estar dos animais.
Para atender a essa necessidade não atendida, apresentamos um protocolo detalhado e abrangente para a realização de injeções intratecais especificamente em filhotes recém-nascidos no dia 1 pós-natal (P1). Seguindo as instruções passo a passo, os pesquisadores podem realizar com confiança injeções intratecais em filhotes neonatais, permitindo a entrega precisa de drogas, oligos antisenso e vírus para substituição de genes ou tratamentos baseados em edição de genoma. Além disso, ressalta-se a importância da adesão às boas práticas laboratoriais para manter o bem-estar dos animais e garantir resultados experimentais confiáveis. Este protocolo visa abordar os desafios técnicos associados às injeções intratecais em camundongos neonatais, facilitando os avanços no campo da pesquisa neurogenética que visa desenvolver potenciais intervenções terapêuticas.
Introduction
A injeção intratecal (TI) é um procedimento clínico comum usado para administrar medicamentos, coletar líquido cefalorraquidiano e manter a pressão intracraniana em pacientes pediátricos e adultos em clínicas 1,2. A administração de medicamentos por injeção intratecal é uma abordagem eficaz para aumentar as concentrações de medicamentos no sistema nervoso central (SNC), minimizando a exposição sistêmica. Consequentemente, esse método aumenta a eficácia terapêutica e reduz os efeitos colaterais, especialmente para fármacos sensíveis à temperatura e de meia-vida curta3.
Em estudos pré-clínicos testando novas drogas e tratamentos utilizando modelos de roedores, é imperativo empregar um método confiável de administração de medicamentos que ofereça maior precisão e reprodutibilidade dos resultados 4,5. Para estudos pré-clínicos que avaliam novos tratamentos para transtornos neurogenéticos e do neurodesenvolvimento, o tratamento precoce é crucial para estudos iniciais de prova de conceito, pois intervenções mais precoces são tipicamente previstas para produzir resultados mais favoráveis 6,7,8.
Em comparação com as injeções intracerebroventriculares (ICV) convencionais, as injeções de IT apresentam riscos significativamente menores, uma vez que evitam a necessidade de penetração direta através do córtex cerebral. Essa vantagem reduz substancialmente o dano potencial ao tecido cortical regional e nervos adjacentes. Além disso, as injeções de TI permitem um aumento de pelo menos cinco vezes no volume administrável de medicamentos por meio de uma única injeção, aumentando consideravelmente a viabilidade de administrações repetidas. No entanto, devido ao pequeno tamanho e à natureza frágil dos camundongos recém-nascidos, a realização de injeções intratecais em filhotes recém-nascidos é tecnicamente desafiadora e requer técnicas especializadas, equipamentos e manuseio meticuloso.
Este artigo fornece um protocolo detalhado com instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em filhotes recém-nascidos P1. As principais considerações e boas práticas de laboratório são enfatizadas aqui para garantir a consistência da administração e a segurança e bem-estar dos animais durante o procedimento. Ao seguir esse protocolo, os pesquisadores podem conduzir experimentos com confiança com precisão e reprodutibilidade, minimizando quaisquer riscos potenciais ou desconforto para os animais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrito é um procedimento passo-a-passo para injeção intratecal em camundongos neonatais (P1), resultando em ampla distribuição de drogas em seus cérebros. Em comparação com o método comum de injeção intracerebroventricular para administração de medicamentos em camundongos neonatais, que envolve perfuração do córtex cerebral11, a injeção intratecal evita lesão direta no cérebro neonatal de camundongos devido à penetração da agulha. Devido à mínima invasividade, a injeçã…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A XNL é apoiada pela Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ também é apoiado pela FAST e NIH Grant R01HD110195 e R01MH117289.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
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