In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der Rate der programmierten Zelltodinitiierung vor, indem wir inokulierte Blätter nach der Induktion des Zelltods kontinuierlich abbilden.
Die durch die Hypersensitive Response (HR) übertragene Resistenz ist eine effektive Abwehrreaktion, die durch die N-Resistenzgene bestimmt werden kann. HR äußert sich durch die Bildung von Zelltodzonen auf inokulierten Blättern. Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Geschwindigkeit der Zelltodinitiierung durch Abbildung von inokulierten Blättern in der Zeit zwischen der Initiierung des Zelltods und dem Auftreten des Zelltods mit einem digitalen Mikroskop vorgestellt. Das digitale Mikroskop ermöglicht einen kontinuierlichen Bildgebungsprozess in gewünschten Intervallen, was eine genaue Bestimmung der Zelltod-Initiierungsrate auf Minuten genau ermöglicht, im Gegensatz zu Stunden bei herkömmlichen Methoden. Die Bildgebung mit dem Digitalmikroskop ist zudem lichtunabhängig und kann daher bei Tag und Nacht eingesetzt werden, ohne den zirkadianen Rhythmus der Pflanze zu stören. Verschiedene Pathosysteme, die zur Entwicklung des programmierten Zelltods führen, konnten mit diesem Protokoll mit geringfügigen Modifikationen untersucht werden. Insgesamt ermöglicht das Protokoll somit eine einfache, genaue und kostengünstige Identifizierung der Zelltod-Initiierungsrate.
Die Kartoffel ist eine der weltweit am häufigsten angebauten Nahrungspflanzen und liegt an vierter Stelle hinter Reis, Weizen und Mais. Die Kartoffelproduktion kann jedoch durch das Kartoffelvirus Y (PVY), das derzeit als wichtigster Viruserreger gilt, stark beeinträchtigt werden 1,2. In Kartoffelpflanzen cv. Rywal lösen mehrere PVY-Stämme (einschließlich des PVY-Stammes N-Wilga) eine durch Überempfindlichkeitsreaktion (HR) übertragene Resistenz aus, bei der sich die Beschränkung des Erregers auf den Infektionsort als nekrotische Läsionen auf inokulierten Blättern manifestiert3. In diesem Pathosystem wird die HR durch das temperaturabhängige Ny-1-Resistenzgen vermittelt, da Pflanzen, die bei niedrigeren Temperaturen angebaut werden, effizient nekrotische Läsionen entwickeln, während bei Pflanzen, die konstitutiv bei erhöhter Temperatur (28 °C) angebaut werden, der Abbruch der Resistenz als mangelnde Läsionsbildung und systemische Virusausbreitung nachgewiesenwird 3,4. Wenn die Pflanzen auf eine niedrigere Temperatur (22 °C) gebracht werden, wird der Zelltod eingeleitet, was ausgenutzt werden kann, um die Geschwindigkeit der Zelltodinitiierung zu verfolgen, indem geimpfte Blätter in der Zeit zwischen der Initiierung des Zelltods und dem Auftreten des Zelltods abgebildet werden.
Dieses Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Bestimmung der Zelltod-Initiierungsrate mit einem digitalen Mikroskop. Durch die Bildgebung der beimpften Blätter nach dem Transfer der Pflanze von 28 °C auf 22 °C ermöglicht ein digitales Mikroskop eine kontinuierliche Beobachtung des Blattes in gewünschten Intervallen. Im Gegensatz zur Verwendung anderer Verfahren (z. B. konfokale Mikroskopie oder Beobachtung der Läsionsbildung mit bloßem Auge) ermöglicht dies die Bestimmung des genauen Zeitpunkts der Läsionsbildung und damit der Zelltodinitiierungsrate auf Minuten genau, im Gegensatz zu Stunden bei den vorgenannten Verfahren 5,6. Die Verwendung des digitalen Mikroskops ist zudem unabhängig vom Licht und kann daher sowohl bei Tag als auch bei Nacht eingesetzt werden. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Komponenten zu identifizieren, die an der Initiierung des Zelltods beteiligt sind, oder um die Auswirkungen verschiedener Komponenten auf die Zelltodinitiierungsrate zu bestimmen, wenn die verwendeten Pflanzen transgen sind und veränderte Mengen an Komponenten von Interesse aufweisen.
Das demonstrierte Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, die Initiationsrate des Zelltods genau zu bestimmen, indem er die inokulierten Blätter in der Zeit zwischen der Initiierung des Zelltods und dem Auftreten des Zelltods mit einem digitalen Mikroskop kontinuierlich abbildet. Obwohl es zahlreiche Möglichkeiten gibt, das Auftreten von Läsionen und Pflanzenkrankheiten zu überwachen12,13,14,15, bietet dieses Protokoll den Vorteil einer lichtunabhängigen Messung ohne Störung des zirkadianen Rhythmus der Pflanze, da das Licht zwischen den Messungen ausgeschaltet wird.
Nach der Inokulation sollten die Pflanzen 3 Tage lang bei 28 °C wachsen. Das Ny-1-Resistenzgen , das eine überempfindliche Reaktion hervorruft, ist temperaturabhängig und führt bei Pflanzen, die bei höheren Temperaturen angebaut werden, zu einem Abbruch der Resistenz, der sich in einer mangelnden Läsionsbildung und einer systemischen Virusausbreitung äußert3. Nachdem die Pflanzen auf 22 °C umgestellt wurden, wird der Zelltod eingeleitet, so dass für genaue Ergebnisse die Beobachtung mit einem digitalen Mikroskop so schnell wie möglich nach diesem Transfer beginnen sollte. Ein weiterer entscheidender Schritt bei der Vorbereitung der Pflanze für die Bildgebung ist die Immobilisierung des Blattes (Abbildung 1D), da die Pflanze während der Bildgebung weiter wächst, was das beobachtete Blatt aus dem Fokus bringen könnte, oder ein solcher Aufbau führt nicht zu den gewünschten Ergebnissen.
Wenn das beschriebene Protokoll auf transgene Pflanzen mit veränderten Komponenten von Interesse angewendet wird, von denen angenommen wird, dass sie an der Initiierung des Zelltods beteiligt sind, ermöglicht das Protokoll dem Benutzer zu bestimmen, ob der verringerte Gehalt einer untersuchten Komponente die Rate der Zelltodinitiierung beeinflusst. Auf diese Weise können mit diesem Protokoll Komponenten identifiziert werden, die an der Initiierung des Zelltods in Pathosystemen beteiligt sind, in denen der programmierte Zelltod stattfindet. Weitere Methoden zur Identifizierung dieser Komponenten sind beispielsweise die transkriptomische Analyse wie RNA-seq oder verschiedene Formen der Mikroskopie, die teuer und zeitaufwändig sein können16. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode ermöglicht eine einfache und kostengünstige Identifizierung von Komponenten, die an der Initiierung des Zelltods beteiligt sind, indem Unterschiede in den Zelltodinitiierungsraten zwischen transgenen und Kontrollpflanzen beobachtet werden. Optimalerweise müssen in einem solchen Aufbau zwei Digitalkameras verwendet werden, da eine transgene Pflanze parallel zu einer Kontrollpflanze im selben Experiment analysiert werden soll.
In diesem Protokoll wurde der PVY-Stamm N-Wilga verwendet; Es könnten jedoch auch andere Stämme dieses Virus verwendet werden, z. B. GFP-markiertes PVY (PVY-N605(123)-GFP)7. Darüber hinaus konnten andere Pathosysteme, die zur Entwicklung des programmierten Zelltods führen, mit diesem Protokoll mit geringfügigen Modifikationen untersucht werden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Barbara Jaklič für die technische Unterstützung. Diese Forschung wurde von der Slowenischen Agentur für Forschung und Innovation finanziell unterstützt (Forschungskernfinanzierung Nr. P4-0165 und Projekt Z4-3217: Entschlüsselung der redoxbezogenen Signalvernetzung in der Kartoffelresistenz gegen Viren).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi![]() |
N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |