כאן אנו מתארים בדיקת פעילות רקמת שלפוחית חוץ-תאית בבית. בדיקות מבוססות פעילות ובדיקות מבוססות אנטיגן שימשו למדידת גורם רקמה בשלפוחיות חוץ-תאיות מדגימות פלזמה אנושיות. לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן.
גורם רקמה (TF) הוא קולטן טרנסממברנה עבור פקטור (F) VII ו- FVIIa. קומפלקס TF/FVIIa יוזם את מפל הקרישה על ידי הפעלת FIX ו- FX. TF משתחרר מתאים למחזור הדם בצורה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV). רמת ה-TF החיובי (+) לרכב חשמלי עולה במחלות שונות, כולל סרטן, זיהומים חיידקיים ונגיפיים ושחמת הכבד, וקשורה לפקקת, קרישה תוך-וסקולרית מפושטת, חומרת מחלות ותמותה. ישנן שתי דרכים למדוד TF+ EV בפלזמה: בדיקות מבוססות אנטיגן ופעילות. הנתונים מצביעים על כך שלבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן. מאמר זה מתאר את בדיקת פעילות ה- EVTF הפנימית שלנו המבוססת על בדיקת דור FXa דו-שלבית. FVIIa, FX וסידן מתווספים לדגימות המכילות TF+ EV כדי ליצור FXa בנוכחות ובהיעדר נוגדן נגד TF כדי להבדיל בין דור FXa תלוי TF לבין דור FXa שאינו תלוי ב- TF. מצע כרומוגני שנבקע על ידי FXa משמש לקביעת רמת FXa, בעוד שעקומה סטנדרטית הנוצרת עם TF רקומביננטי משומן משמשת לקביעת ריכוז TF. לבדיקת פעילות EVTF פנימית זו יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקת פעילות TF מסחרית.
קרישת הדם מתחילה עם קשירה של גורם (F) VII/VIIa לגורם רקמה (TF)1. קומפלקס TF/FVIIa מפעיל הן את FIX והן את FX כדי להפעיל קרישת דם1. ישנן שתי צורות של TF באורך מלא, קשור לקרום: מוצפן ופעיל. בנוסף, קיימת צורה חלופית של TF (asTF). ספינגומיילין ופוספטידילכולין בעלון החיצוני של קרום התא שומרים על TF במצב מוצפן 2,3,4. כאשר תאים מופעלים או ניזוקים, סקרמבלאז פוספוליפידים מעביר פוספטידיל-סרין ופוספוליפידים אחרים בעלי מטען שלילי לעלון החיצוני1. הפעלת התאים גורמת גם לטרנסלוקציה של חומצה sphingomyelinase לעלון החיצוני, שם הוא מפרק sphingomyelin ל ceramide5. שני מנגנונים אלה ממירים TF מוצפן לצורה הפעילה. כמו כן מוצע כי חלבון דיסולפיד איזומראז מתווך היווצרות קשר דיסולפיד בין Cys186 ו- Cys209 ב- TF מוצפן, מה שמביא לביטול הצפנה של TF 6,7,8. asTF קיים גם במחזור הדם אך חסר את תחום הטרנסממברנה ולכן הוא מסיס 9,10. חשוב לציין, ל- asTF יש רמות נמוכות מאוד של פעילות מעודדת קרישה בהשוואה ל- TF פעילבאורך מלא 10,11.
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משתחררות מתאים מארחים נחים, מופעלים וגוססים, כמו גם מתאי סרטן12. כלי רכב חשמליים מבטאים חלבונים מתאי הוריהם12. EV פעילים נושאי TF משוחררים ממונוציטים פעילים, תאי אנדותל ותאי גידול למחזור הדם 13,14,15. רמות TF בפלזמה ניתנות למדידה על ידי בדיקות מבוססות פעילות ואנטיגן. בדיקות מבוססות אנטיגן כוללות ELISA וציטומטריית זרימה16. ישנן שתי בדיקות שונות מבוססות פעילות: מבחני פעילות TF חד שלבית ודו-שלבי. הבדיקה החד-שלבית מבוססת על בדיקת קרישה מבוססת פלזמה. הדגימה המכילה TF מתווספת לפלזמה והזמן ליצירת קריש נמדד לאחר הסתיידות מחדש. הבדיקה הדו-שלבית מודדת את דור הדגימות של FXa על ידי הוספת FVII או FVIIa, FX וסידן. רמות FXa נקבעות באמצעות מצע שנבקע על ידי FXa.
הן במבחני פעילות TF חד-שלבית והן בשני שלבים, ריכוז ה-TF נקבע באמצעות עקומה סטנדרטית הנוצרת עם TF רקומביננטי. לבדיקות דו-שלביות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר לבדיקה החד-שלבית. מחקרים רבים אישרו כי לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן 17,18,19,20,21. בנוסף, לבדיקת הפעילות הפנימית שלנו יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר לבדיקת פעילות מסחרית22. לאנשים בריאים יש רמות נמוכות מאוד או בלתי ניתנות לגילוי של פעילות EVTF בפלזמה. לעומת זאת, לאנשים עם מצבים פתולוגיים, כגון סרטן, שחמת, אלח דם וזיהום ויראלי, יש רמות ניתנות לזיהוי של פעילות EVTF וזה קשור לפקקת, קרישה תוך וסקולרית מפושטת, חומרת המחלה, ותמותה 23,24,25,26,27,28. כאן, נתאר את בדיקת הפעילות הדו-שלבית של EVTF.
כאן מוצג הפרוטוקול של בדיקת פעילות ה- EVTF הפנימית שלנו. ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול. בעת בנייה מחדש של כדורית EV, חשוב לבצע פיפטה למעלה ולמטה במיקום של גלולת EV גם אם היא אינה נראית לעין. הרכבה מחדש חלקית של כדורית EV תגרום להערכה שלילית שגויה או הערכת חסר של ערכי פעילות EVTF של הדגימות. שני?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) ופרופסורת ג’ון סי פארקר (N.M). ברצוננו להודות לגב’ סיירה ארצ’יבלד על הערותיה המועילות
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |