생물학적 세포의 기계적 피로를 평가하기 위한 진폭 변조 전형성
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 진폭 변조 전극 형성 접근법을 사용하는 인간 적혈구의 경우 기계적 피로 테스트를 위한 프로토콜입니다. 이러한 일반적인 접근법은 순환 변형으로부터 현탁액에서 생물학적 세포의 형태학적 및 생체역학적 특성의 체계적인 변화를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.
Abstract
적혈구(RBC)는 놀라운 변형성으로 유명합니다. 그들은 미세 순환을 통과 할 때 반복적으로 상당한 변형을 겪습니다. 감소된 변형성은 생리학적으로 노화된 적혈구에서 볼 수 있습니다. 세포 변형성을 측정하는 기존의 기술은 피로, 주기적 부하에 의해 유발되는 세포막의 점진적인 분해를 측정하는 데 쉽게 사용할 수 없습니다. 우리는 미세유체 채널에서 진폭 편이 키잉(ASK) 변조 기반 전출을 사용하여 주기적 전단 응력으로 인한 적혈구의 기계적 열화를 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 간단히 말해서, 미세유체 채널 내의 인터디지팅된 전극들은 신호 발생기를 사용하여 무선 주파수에서 저전압 교류로 여기된다. 현탁액의 적혈구는 전기장에 반응하고 세포를 전극 가장자리로 이동시키는 양성 전동영동(DEP)을 나타냅니다. 그런 다음 두 셀 반쪽에 가해지는 전기력으로 인해 셀이 늘어나 전극 형성으로 알려진 단축 스트레칭이 발생합니다. 전단 응력의 수준과 그에 따른 변형은 여기파의 진폭을 변경하여 쉽게 조정할 수 있습니다. 이를 통해 높은 처리량에서 크고 작은 변형에 대한 반응으로 RBC의 비선형 변형성을 정량화할 수 있습니다. ASK 전략으로 여기파를 수정하면 프로그래밍 가능한 로딩 속도와 주파수로 순환 전극 형성이 유도됩니다. 이는 RBC 피로의 특성화를 위한 편리한 방법을 제공합니다. 당사의 ASK 변조 전극 형성 접근법은 처음으로 주기적 하중으로 인한 RBC 피로를 직접 측정할 수 있게 해줍니다. 다른 세포 유형 및 질병 조건에서 세포 변형성 및 피로를 분석하기 위한 일반적인 생체역학적 테스트를 위한 도구로 사용할 수 있으며 산소 장력 및 생물학적 및 화학적 신호와 같은 세포의 미세 환경을 제어하는 전략과 결합할 수도 있습니다.
Introduction
적혈구(RBC)는 인체에서 가장 변형되기 쉬운 세포입니다1. 변형성은 산소 운반 기능과 직접적인 관련이 있습니다. 적혈구의 감소된 변형성은 여러 적혈구 장애의 발병기전과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다2. 변형성 측정을 통해 적혈구 관련 질병에 대한 더 나은 이해를 얻을 수 있었습니다3. 적혈구의 정상 수명은 70일에서 140일까지 다양하다4. 그러므로, 노화 과정에 따라 변형성이 어떻게 감소하는지, 예를 들어 주기적 전단 응력으로 인한 피로 거동을 측정하는 것이 중요하다3.
높은 처리량에서 RBC 변형성을 측정하는 것은 개별 셀에 적용되는 피코네톤 스케일 힘(~10-12 N) 때문에 어렵습니다. 지난 10년 동안 세포 변형성을 측정하기 위한 많은 기술들이 개발되었다5. 단일 세포 수준에서 적혈구의 변형 측정은 피펫 흡인 및 광학 핀셋으로 수행할 수 있으며, 벌크 분석은 삼투압 구배 ektacytometry로 수행할 수 있습니다. Ektacytometry 분석은 혈액 질환을 진단 할 수있는 기회를 제공하는 풍부한 데이터를 제공합니다 6,7. 적혈구의 변형성은 콜로이드 프로브 원자력 현미경에 의한 점탄성 이론을 사용하여 분석할 수도 있습니다. 이 방법에서는 시간 종속 응답과 정상 상태 응답을 모두 고려하여 RBC의 탄성 계수를 추정하기 위해 계산 분석이 적용됩니다. 개별 적혈구의 변형성은 단일 셀 마이크로챔버 어레이 방법을 사용하여 측정할 수 있습니다. 이 방법은 혈액학적 장애를 검출하기 위해 복잡한 적혈구 집단에서 RBC 변형성 및 세포 특성의 분포에 대한 정보를 제공하기 위해 막 및 세포질 형광 마커를 통해 각 세포를 분석한다8.
피로는 엔지니어링 재료 및 생체 재료의 특성 저하의 핵심 요소입니다. 피로 시험은 주기적 하중을 받는 구조물의 무결성과 수명에 대한 정량적 해석을 가능하게 합니다. 생물학적 세포에서의 피로 분석은 세포막에서 순환 변형을 구현하기 위한 일반적이고 쉽게 적용할 수 있는 높은 처리량 및 정량적 방법의 부족으로 인해 오랫동안 방해를 받아 왔습니다. 이것은 미세 유체 설정에서 구현된 전기 신호 변조 및 전기 형성 기술의 활용으로 가능합니다. 디지털 변조로서의 ASK(Amplitude Shift Keying) 기술은 이 기사에서 OOK(On-Off Keying) 변조를 통해 적용됩니다. 키잉(keying)의 개념은 채널을 통해 디지털 신호를 전송하는 것을 말하며, 이를 위해서는 사인파 반송파 신호가 작동해야 한다(9). ON과 OFF 시간을 동일하게 설정할 수 있습니다. ON-keying에서 RBC는 불균일한 전기장에 의해 생성된 외부 전기력(Fdep)10 에 노출되는 동안 변형된 상태로 들어갑니다. 오프 키잉(OFF-keying)에서 RBC는 완화된 상태에 있습니다. 우리는 적혈구의 피로, 즉 로딩 주기가 증가함에 따라 늘어나는 능력의 점진적인 저하를 관찰합니다. 적혈구의 피로로 인한 변형성 손실은 혈액 순환 중 축적된 막 손상에 대한 통찰력을 제공하여 세포 피로와 질병 상태 사이의 연관성을 추가로 조사할 수 있도록 합니다.
여기에서는 ASK 변조 전착을 통해 미세 유체 장치에서 적혈구의 피로 테스트를 구현하는 방법과 미세 유체 장치, 기계적 하중 및 적혈구의 기계적 변형성의 점진적인 저하 특성화를 위한 미세 유체 장치, 기계적 하중 및 미세 상상과 같은 시스템 설정에 대한 단계별 절차를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DEP 힘 유도 사인파의 ASK OOK 변조는 장기간에 걸쳐 적혈구의 기계적 피로를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 세포 변형성에 대한 잠재적인 대사 부작용을 방지하기 위해 시험관 내 피로 테스트를 1시간으로 제한했습니다. 포괄적인 피로 시험 조건은 ASK 변조 전착 기술을 사용하여 프로그래밍할 수 있습니다. 로딩 주파수, 진폭 및 로딩 속도와 같은 파라미터를 모두 프로그래?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers(#1941655) 및 NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells(#1635312)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Referencias
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