경내피 전기 저항 검출을 통한 bEnd.3 혈관 내피 세포의 장벽 기능 무결성 기록
Summary
이 프로토콜은 뇌 혈액 장벽의 신뢰할 수 있고 효율적인 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스 대뇌 혈관 내피 세포 bEnd.3를 사용하고 막관통 전기 저항을 측정합니다.
Abstract
혈액뇌장벽(BBB)은 미세혈관 내피세포, 성상세포, 주위세포로 구성된 역동적인 생리학적 구조입니다. BBB는 유해 물질의 제한된 통과, 영양소 흡수 및 뇌의 대사 산물 제거 사이의 상호 작용을 조정함으로써 중추 신경계 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. BBB의 체외 모델 구축은 신경 장애의 병태생리학을 탐구하고 약리학적 치료법을 만드는 데 유용한 도구입니다. 이 연구는 24웰 플레이트의 상부 챔버에 bEnd.3 세포를 파종하여 시험관 내 단층 BBB 세포 모델을 생성하는 절차를 설명합니다. 세포 장벽 기능의 무결성을 평가하기 위해 기존의 상피 세포 전압계를 사용하여 정상 세포와 CoCl2 유도 저산소 세포의 막횡단 전기 저항을 실시간으로 기록했습니다. 우리는 위의 실험이 BBB의 체외 모델 및 중추 신경계 질환의 장애를 치료하는 약물을 만드는 데 효과적인 아이디어를 제공할 것으로 기대합니다.
Introduction
BBB는 혈관 내피 세포, 주위 세포, 성상 세포, 뉴런 및 기타 세포 구조로 구성된 혈액 순환과 신경 조직 사이의 독특한 생물학적 인터페이스입니다1. 혈액과 뇌 사이의 이온, 화학 물질 및 세포의 흐름은 이 장벽에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이 항상성은 독소와 병원균으로부터 신경 조직을 보호하는 동시에 뇌 신경의 적절한 작동을 가능하게 합니다 2,3. BBB의 무결성을 유지하면 신경 기능 장애, 부종 및 신경 염증과 같은 중추 신경계에 영향을 미치는 장애의 발생 및 진행을 효과적으로 예방할 수 있습니다4. 그러나 BBB의 독특한 생리학적 특성으로 인해 저분자 약물의 98% 이상과 고분자 약물의 100% 이상이 중추신경계에 들어가는 것을 방지할 수 있다5. 따라서 중추 신경계에 대한 약물 개발 중에 BBB를 통한 약물 침투를 증가시키는 것은 치료 효능을 달성하는 데 필수적입니다 6,7. 기질의 컴퓨터 시뮬레이션 스크리닝으로 인해 약물 후보 물질이 BBB를 통과할 확률이 크게 높아졌지만, 과학 연구의 요구를 충족하기 위해서는 여전히 신뢰할 수 있고 저렴한 in vitro/in vivo BBB 모델이 필요하다8.
고처리량 약물 스크리닝을 위한 빠르고 저렴한 기술은 in vitro 모델9입니다. BBB 기능에 대한 의약품의 효과와 질병의 발병 및 진행에 대한 의약품의 역할의 근본적인 과정을 밝히기 위해 일련의 단순화된 체외 BBB 모델이 만들어졌습니다. 현재, 일반적인 in vitro BBB 모델은 혈관 내피 세포와 성상세포, 주위 세포 또는 미세아교세포(microglia)에 의해 구성된 단층, 공동 배양, 동적 및 미세유체 모델(10,11,12)이다(13,14). 3D 세포 배양은 BBB15의 생리학적 구조와 더 일치하지만, BBB에 대한 약물 스크리닝 수단으로서의 적용은 복잡한 설계와 수준 이하의 재현성으로 인해 여전히 제약을 받고 있습니다. 대조적으로, 단층 in vitro 모델은 BBB를 연구하는 데 가장 자주 사용되는 모델이며 특정 세포에서 막 수송체 및 밀착 접합 단백질의 발현을 결정하는 데 적용할 수 있습니다.
막관통 전기 저항(TEER) 측정은 저항을 가로지르는 셀 층을 평가 및 모니터링하고 장벽의 셀 무결성 및 투과성을 평가하는 기술입니다. 단층(monolayer)의 어느 한쪽에 있는 성장 매체 또는 완충 용액에 2개의 전극을 동시에 삽입함으로써, 전지의 조밀한 층(16,17)을 통해 교류 또는 전기 임피던스를 측정할 수 있다. 시험관 내 BBB 모델이 적절하게 생성되었는지의 여부를 결정하기 위해, TEER의 측정은 통상적으로 골드 스탠다드(gold standard)18로 채택될 것이다. 한편, BBB 투과성에 대한 약물 작용의 경향은 약물 침범 후 세포층의 전기 저항 변화를 측정함으로써 정확하게 예측할 수 있다19. 예를 들어, Feng et al.은 catalpol (rehmanniae의 주요 활성 단량체)이 BBB에서 단단한 접합 단백질의 지질 다당류 유도 하향 조절을 효과적으로 역전시키고 마우스 뇌 내피 세포층20의 TEER 값을 높일 수 있음을 발견했습니다.
신경염증 반응은 일반적으로 BBB 항상성 불균형의 주요 원인이다21. 신경염증성 손상을 유발하는 저산소 치료는 혈액뇌장벽을 파괴하는 주요 방법이며, 주로 물리적 방법과 화학적 시약방법을 포함합니다. 전자는 저산소 조건(22)을 시뮬레이션하기 위해 세포 성장 환경에서의 산소 함량을 변화시키기 위해 주로 3-기체 인큐베이터를 이용하는 반면, 후자는 CoCl2와 같은 데옥시 시약을 세포 배양 배지(23)에 인위적으로 도입함으로써 달성된다. 헴에서 Fe2 +가 Co2 +로 치환되면 세포는 탈산소 상태로 유지됩니다. 촉매 그룹에서 Fe2 +가 Co2 +로 치환되면 프롤린 하이드 록실 라제 및 아스파르테이트 하이드 록실 라제 활성이 억제되어 저산소증 유도 인자 -1α (HIF-1α) 24가 축적됩니다. 지속적인 저산소증 상태에서 세포질에서 HIF-1α의 탈인산화는 세포 사멸을 유발하고 혈관 내피 성장 인자를 활성화하여 궁극적으로 혈관 투과성을 높입니다. 이전 연구25,26에서, 저산소증이 내피 밀착 접합 단백질의 발현을 현저히 감소시켜 BBB의 투과성을 증가시킬 수 있다는 것이 잘 입증되었습니다. 이 연구에서는 간단한 BBB 모델을 만들기 위해 24웰 플레이트에 파종된 bEnd.3 세포의 시간 저항 곡선을 측정했습니다. 이 모델을 사용하여 BBB 보호를 위한 약물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 세포 모델을 구성하기 위해 CoCl2 개입 후 세포 TEER의 변화를 특성화했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
가장 발달된 신체 기관 중 하나인 뇌는 기억, 인지, 청각, 후각, 운동 등 다양하고 복잡한 생리적 과정을 관장한다27. 뇌는 인체에서 가장 복잡하고 병든 기관 중 하나이다. 많은 중추신경계 장애의 발생은 대기 오염, 불규칙한 식습관 및 기타 요인을 포함한 요인으로 인해 해마다 증가하는 경향을 보인다 27,28,29.</su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
중국 국립 자연 과학 재단(82274207 및 82104533), 닝샤 중점 연구 개발 프로그램(2023BEG02012) 및 청두 중의학 대학 Xinglin Scholar Research Promotion Project(XKTD2022013)의 재정적 지원에 감사드립니다.
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
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