Epon Post Embedding 相関光電子顕微鏡
Summary
mScarletと呼ばれる蛍光タンパク質を使用したEponの埋め込み後相関光および電子顕微鏡の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、蛍光と超微細構造を同時に維持できます。この技術は、さまざまな生物学的用途に適しています。
Abstract
光電子相関顕微鏡(CLEM)は、蛍光顕微鏡(FM)によって得られる局在情報と、電子顕微鏡(EM)によって取得された細胞の微細構造のコンテキストを組み合わせた包括的な顕微鏡です。CLEMは蛍光と超微細構造のトレードオフであり、通常、超微細構造は蛍光を損ないます。メタクリル酸グリシジル、HM20、K4Mなどの他の親水性包埋樹脂と比較して、エポンは超微細構造の保存と切断特性に優れています。以前、mEosEMが四酸化オスミウムの固定とエポンの包埋に耐えられることを実証しました。mEosEMを用いて、蛍光と超微細構造を同時に維持するEpon post embedd CLEMを世界で初めて実現しました。ここでは、EMサンプルの調製、FMイメージング、EMイメージング、および画像アライメントについて、ステップバイステップで詳しく説明します。また、EMイメージング中にFMイメージングで画像化された同じ細胞を識別する手順を改善し、FM画像とEM画像間のレジストレーションを詳細に説明します。私たちは、従来のEM施設でこの新しいプロトコルに従って、Epon post埋め込み相関光および電子顕微鏡を簡単に実現できると信じています。
Introduction
蛍光顕微鏡(FM)を使用して、標的タンパク質の局在と分布を得ることができます。しかし、標的タンパク質を取り巻くコンテキストが失われているため、標的タンパク質を徹底的に調べるためには非常に重要です。電子顕微鏡(EM)は、イメージング分解能が最も高く、細胞内の詳細をいくつか提供します。それにもかかわらず、EMにはターゲットラベリングがありません。FMで撮影した蛍光画像とEMで取得した灰色画像を正確に合成することにより、相関光電子顕微鏡(CLEM)は、これら2つのイメージングモード1,2,3,4で得られた情報を組み合わせることができます。
CLEMは、蛍光と超微細構造1のトレードオフである。現在の蛍光タンパク質と従来のEMサンプル調製手順、特にオスミン酸(OsO4)やEponなどの疎水性樹脂の使用には限界があるため、超微細構造は常に蛍光を損ないます5。OsO4 は、EM画像のコントラストを改善するために使用されるEMサンプル調製に不可欠な試薬です。他の包埋樹脂と比較して、エポンは超微細構造の保存と切断特性に優れています5。しかし、OsO4 およびEpon embedding6の処理後に蛍光シグナルを保持できる蛍光タンパク質はありません。蛍光タンパク質の限界を克服するために、EMサンプル調製の前にFMイメージングを行うプレエンベディングCLEMが開発されました6。しかし、CLEMを事前に埋め込むことの欠点は、FM画像とEM画像の間のレジストレーションが不正確である5。
それどころか、ポストエンベディングCLEM法は、EMサンプル調製後にFMイメージングを行い、その登録精度は6〜7nmに達する可能性があります5,6。蛍光タンパク質の蛍光を保持するために、超低濃度のOsO4(0.001%)3または高圧凍結(HPF)および凍結置換(FS)EM調製法4,7が使用されてきましたが、微細構造の損傷やEM画像のコントラストが犠牲になっています。mEos4bの開発は、包埋樹脂としてグリシジルメタクリレートが用いられているが、ポスト包埋型CLEMの進行を大きく促進する5。OsO4染色とエポン包埋に耐えられるmEosEMの開発により、蛍光と超微細構造を同時に維持するエポンポスト包埋超解像CLEMが初めて達成されました6。mEosEMの後、OsO4染色とEpon包埋に耐えられるいくつかの蛍光タンパク質が開発されました8,9,10,11。これにより、CLEMの開発が大幅に促進されます。
EponのポストエンベデッドCLEMには3つの重要な側面があります。1つ目は蛍光タンパク質で、EMサンプル調製後も蛍光シグナルを維持する必要があります。私たちの経験によると、mScarletは他の報告された蛍光タンパク質よりも優れています。2つ目は、FMイメージングで撮像した同じ細胞をEMイメージングで見つける方法です。この問題を解決するために、このステップの手順を改善して、目的の細胞を簡単に見つけられるようにします。最後は、FM画像とEM画像を合わせる方法です。ここでは、FM画像とEM画像間のレジストレーションについて詳しく説明します。このプロトコルでは、VGLUT2ニューロンでmScarletを発現し、mScarletがEponポスト埋め込みCLEMを使用して二次リソソームを標的にできることを実証します。エポンの埋め込み後CLEMについて、蛍光と超微細構造を損なうことなく、段階的に詳しく説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するプロトコールは、光学顕微鏡(LM)からの標的タンパク質の局在情報と、電子顕微鏡(EM)からの標的タンパク質を取り巻く状況を組み合わせることができる汎用性の高いイメージング方法です6。現在の蛍光タンパク質には限界があるため、広く使用されている方法は、EMサンプル調製の前にLMイメージングが行われることを意味する、相関光電子顕微鏡(CLEM)の事前…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、中国国家自然科学基金会(Zhifei Fu 32201235)、中国福建省自然科学基金会(2022J01287 to Zhifei Fu)、福建医科大学先端人材研究財団(Zhifei Fu XRCZX2021013)、中国福建省金融特別科学基金会(22SCZZX002 to Zhifei Fu)、 NHC重点実験室、非ヒト霊長類の生殖能力調節技術評価、福建省母子保健病院(2022-NHP-04からZhifei Fu)の設立。福建医科大学公共技術サービスセンターのLinying Zhou氏、Minxia Wu氏、Xi Lin氏、Yan Hu氏には、EMサンプル調製とEMイメージングのサポートに感謝します。
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
Referencias
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