B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出と定量(英語)
Summary
B型肝炎ウイルス(HBV)DNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの検出および定量は、HBV感染を診断およびモニタリングするための高感度で正確な方法です。ここでは、HBV DNA検出とサンプルのウイルス量測定のプロトコルを紹介します。
Abstract
B型肝炎ウイルス(HBV)は、世界中の肝疾患の重要な原因です。急性または慢性感染症を引き起こす可能性があり、致命的な肝硬変や肝臓がんに非常にかかりやすくなります。血液中のHBV DNAの正確な検出と定量は、HBV感染の診断とモニタリングに不可欠です。HBV DNAを検出する最も一般的な方法はリアルタイムPCRであり、ウイルスを検出し、ウイルス量を評価して抗ウイルス療法への反応をモニターするために使用できます。ここでは、IVDマーク付きリアルタイムPCRベースのキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なプロトコルについて説明します。このキットは、HBVゲノムの高度に保存されたコア領域を標的とするプライマーとプローブを使用しており、すべてのHBV遺伝子型(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)を正確に定量できます。このキットには、PCR阻害の可能性を監視するための内因性内部コントロールも含まれています。このアッセイは 40 サイクル実行され、カットオフは 38 カラットです。 臨床サンプル中の HBV DNA を定量するために、5 種類の定量標準試料がキットに付属しています。この標準物質には、核酸検査用のHBV DNAに関するWHO第4国際 規格(NIBSCコード10/266)に照らして校正されたHBV特異的DNAの既知の濃度が含まれています。この標準試料は、HBV特異的DNA増幅の機能を検証し、検量線を作成するために使用され、サンプル中のHBV DNAの定量を可能にします。2.5 IU/mLという低濃度のHBV DNAをPCRキットを用いて検出しました。このキットは感度と再現性が高いため、臨床検査室での強力なツールとなり、医療従事者がHBV感染症を効果的に診断・管理するのに役立ちます。
Introduction
B型肝炎ウイルス(HBV)は、オルソヘパドナウイルス属およびヘパドナウイルス科1に属する部分二本鎖DNAウイルスです。生涯にわたって持続する慢性感染症を引き起こし、肝硬変や肝細胞癌を引き起こす可能性があります2,3,4。世界保健機関(WHO)によると、2019年には推定2億9,600万人が慢性B型肝炎に感染し、毎年150万人が新たに感染しています5。
血清または血漿サンプル中のHBV DNAの同定と測定は、進行中のB型肝炎感染患者を検出し、抗ウイルス治療の有効性を評価し、治療の成功確率を予測するための貴重な方法として機能します6,7,8,9,10,11。ウイルス量が多いと、肝硬変や肝がんなどの肝疾患の進行リスクが高まります12,13。したがって、ウイルス量の正確な測定は、HBV感染の進行を追跡し、治療に関する決定に情報を提供するために重要です。
定量的リアルタイムPCRアッセイは、従来のPCR技術よりも感度が高く、ダイナミックレンジが広く、HBV DNAの定量精度が高い14,15,16,17。血清または血漿サンプル中のHBV DNAを定量するための市販のリアルタイムPCRベースの分子診断キットがいくつか市場に出回っています。ここでは、市販のIVDマーク付きリアルタイムPCRベースキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なワークフローについて説明します。このキットは、広く使用されている18,19、低コストでありながら高感度のアッセイであり、その性能特性は、他の市販のCEマーク付きキットに匹敵します18。HBV標的領域の増幅とは別に、内在性内部制御遺伝子もキットに含まれており、サンプルの品質、抽出されたDNAの品質、PCR増幅、およびPCR阻害の可能性を検証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
NIBSC コード 10/266 には、サプライヤー情報21 に従って 9,55,000 mL のヌクレアーゼフリー水に再構成した場合、0.5 IU/mL の単位が割り当てられています。これは、高負荷のHBV陽性サンプルと見なすことができます。この研究で使用したウイルス量キットで測定したHBVウイルス量は6,65,900 IU/mLでした(図4)。DNA抽出キットのDNA抽出効率は100%ではないため、精製プ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
技術支援をしてくれたPraveen氏、Kusum氏、Chandan氏、Isha氏、Rashmi氏、Babli氏、Shivani氏、Ankita氏、Shikha氏に感謝の意を表します。
Materials
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
Referencias
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