Summary

Shrinky-Динка Висячие Капли: Простой способ Форма и культуры эмбриоидные тела

Published: March 05, 2008
doi:

Summary

Мы показываем, простой и быстрый метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин и поддерживать их на эмбриоидных развития организма.

Abstract

Эмбриоидных органов (EB) являются агрегатами эмбриональных стволовых клеток. Наиболее распространенным способом создания этих агрегатов методом висячей капли, трудоемкий подход пипетирования произвольное количество клеток в хорошо пластин. Взаимодействий между стволовыми клетками вынуждены непосредственной близости друг от друга способствует поколения EBS. Потому что средства массовой информации в каждой из скважин вручную обменялись каждый день, этот подход вручную интенсивно.

Более того, поскольку параметры окружающей среды, включая сотовые-ячейки и растворимые взаимодействия фактора, рН и наличие кислорода могут быть функциями EB размер, клеточных популяций получены от традиционных висят капли могут резко меняться даже при культивировании в одинаковых условиях. Недавние исследования показали, что действительно начальное количество клеток, образующих совокупности может оказать существенное воздействие на стволовые дифференциации клеток. Мы разработали простой, быстрой и масштабируемой культуры метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин и сохранить их для эмбриоидных развития организма. Наконец, эти клетки были легко доступны для дальнейшего анализа и экспериментов. Этот метод поддается любой лаборатории и не требует специализированного оборудования. Мы показываем этот метод путем создания эмбриоидных органов использованием красного флуоресцентного клеточной линии мыши (129S6B6-F1).

Protocol

1. Создание Shrinky-Mold Динка Печать желаемый рисунок на shrinky-Динка листа с помощью хорошего принтера определение. Выпекать shrinky-Динка листа при 163 ° С около 10 минут, или пока он полностью не уменьшились, а получив правильной формы. После shrinky-Динка плесень остынет, погрузите ег?…

Discussion

Мы разработали простой, быстрой и масштабируемой культуры метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин (отлит из Shrinky-Dinks) и сохранить их для эмбриоидных развития организма. Наконец, эти клетки были легко доступны для дальнейшего анализа и экспериментов. Этот мет?…

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить CIRM за поддержку этой работы. Клеточная линия была щедро пожертвовал от доктора Андраш Надь в больнице Маунт Синай в Торонто, Онтарио.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Shrink-Dink Film Material K&B Innovations D300-10A
PDMS Material Dow Corning Sylgard 184
Acetone Reagent Fisher Scientific A16P-4
Ethanol Reagent Fisher Scientific A405P-4
PBS Reagent Sigma P4417
BMP-4 Reagent R and D systems 314-BP-010
Knock-Out DMEM (KO DMEM) Reagent Invitrogen 10829
KnockOut Sirum Replacement (KSR) Reagent Invitrogen 10828
Penn-Strep Reagent Invitrogen 15070-063
L-glutamine Reagent Invitrogen 25030-081
Non-essential Amino Acids (NEAA) Reagent Invitrogen 11140
D-mercaptoethanol (BME) Reagent Calbiochem 444203
Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} Reagent Chemicon ESG1106
Printer Tool HP Laser Jet 2420d
Oven Tool Yamato Scientific DP-22
For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM)

Referencias

  1. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
  2. Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
  3. Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
  4. Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
  5. Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
  6. Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
  7. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).

Play Video

Citar este artículo
Chen, C., Pegan, J., Luna, J., Xia, B., McCloskey, K., Chin, W., Khine, M. Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (13), e692, doi:10.3791/692 (2008).

View Video