Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz
Summary
Nós desenvolvemos o Response Visual-Motor para quantificar a saída do motor de zebrafish larval em resposta aos aumentos de luz e diminui. Também examinamos os mutantes visão zebrafish, incluindo a resposta não optocinético (NRC) mutantes, que foram pensados para serem completamente cego quando testado por um outro ensaio de visão, o reflexo optocinético.
Abstract
O reflexo optocinético (OKR) é um visual básico reflexo exibida pela maioria dos vertebrados e desempenha um papel importante na estabilização do olho em relação à cena visual. No entanto, o OKR exige que um animal detectar riscas em movimento e é possível que os peixes que não exibem um OKR não pode ser completamente cega. Um peixe-zebra mutante, a não optocinético resposta c (NRC) não tem nenhuma OKR sob quaisquer condições de luz testadas e foi relatado para ser completamente cego. Anteriormente, mostramos que OFF-atividade das células ganglionares podem ser gravadas nestes mutantes. Para determinar se os peixes mutantes sem OKR como o mutante nrc pode detectar incrementos de luz simples e decrementa nós desenvolvemos o teste do motor visuais comportamentais (VMR). Neste ensaio, larvas do peixe única são colocados em cada poço de uma placa de 96 poços permitindo o monitoramento simultâneo de larvas através de um sistema de vídeo monitoramento automatizado. As respostas locomotor de cada larva a 30 minutos-luz ON e 30 minutos OFF luz foram registrados e quantificados. WT peixes têm um pico breve da atividade motora sobre luzes ON, conhecida como a resposta de sobressalto, seguido pelo retorno a menor do que a atividade de base, chamada de congelar. Peixes WT também aumentar drasticamente sua atividade locomotora imediatamente após luzes apagadas e apenas gradualmente (durante vários minutos) retornar à atividade locomotora basal. Os mutantes nrc responder de maneira similar à luz OFF como peixes WT, mas apresentam uma ligeira redução em sua atividade média, em comparação aos peixes WT. Atividade motora em resposta à luz ON em nrc mutantes é atrasado e lento. Há um tempo de subida lenta da resposta mutante nrc à luz ON, em comparação com luz WT ON resposta. Os resultados indicam que os peixes nrc não são completamente cegos. Porque teleósteos podem detectar a luz através da retina não-tecidos, que confirmou que as respostas imediatas de comportamento à luz de intensidade mudanças requerem olhos intactos usando o chokh (chk) mutantes, o que falta completamente os olhos, desde os primeiros estágios de desenvolvimento. No nosso ensaio VMR, os mutantes chk não apresentam resposta de sobressalto a qualquer luz ON ou OFF, mostrando que os olhos laterais mediar esse comportamento. O ensaio aqui descrito VMR complementa o ensaio OKR bem estabelecido, que não testa a capacidade de larvas de peixe-zebra para responder às mudanças nas intensidades de luz. Além disso, a automação do ensaio VMR se presta a high-throughput screening para defeitos de intensidade leve-driven respostas visual.
Protocol
Discussion
Os procedimentos experimentais que mostram no filme são todos representativos de peixes WT. No entanto, estas experiências podem ser feitas de forma análoga em peixes mutantes também (ver secção resultado representativo). Sugerimos aos peixes placa WT e peixes mutantes na mesma placa em um esboço placa de verificador para fins de controle ótimo.
Ao usar peixes mutantes no mesmo prato como peixe WT certifique-se que você anote o tipo de peixe era banhado em cada poço. Aqui está uma sugestão sobre como acompanhar o peixe b…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde EY0081 e 5T32UY07145 e pela Fundação Eye Cavaleiros Templários. Jason Rihel é membro Bristol-Squibb das Ciências da Vida Research Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microplate devices | Tool | Whatman | 7701-1651 | |
| Transfer pipetes | Tool | VWR | 202205 | |
| Fish water | Reagent | refer to reference #4 | ||
| Recording chambers (Zebrabox) | Tool | Viewpoint Lifesciences | ||
| Videotrack Software | Tool | Viewpoint Lifesciences |
Referencias
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).
