Gonad Microinjection: En metode til sammensat levering direkte ind i kimen af C. elegans

- For at forberede injektionen, brug en orm pick til at lægge et spor af halocarbon olie på en agarose pad. Placer orme i olien og immobilisere dem ved forsigtigt at skubbe dem på agar pad. Sørg for olien fuldt dækker dyrene. Det giver ilt til at komme til ormeneogsamtidig forhindre udtørring. Næste, placere agarose pad på en injektion mikroskop og placere nålen vinkelret på ormen, rettet mod distale ende af en gonad arm. 

Skub forsigtigt nålen gennem kutikula og injicere gonad arm med nukleinsyre eller forbindelse af interesse. Hver gonad arm indeholder en kimlinje syncytium, der vil udvikle sig til individuelle oocytter. Materiale injiceres i distale gonad vil blive indarbejdet i disse oocytter og påvirke den næste generation.

Efter injektion orme, erstatte olien med M9 buffer. Når ormene begynder at bevæge sig, overføre dem til en NGM agar plade med bakteriel mad. I den følgende protokol, gonad mikroinjection metode bruges til at levere en Cas9 kompleks til at målrette og redigere dpy-10 genet.

- Begynd med forberedelse af C. elegans og agarose puder som beskrevet i tekstprotokollen. Brug en orm pick til at lægge et lille spor af halocarbon olie langs den ene kant af puden. Derefter bruge ormen pick belagt med olie til at løfte flere orme fra NG agar plade og ind i sporet af olie. Med et fint hår fastgjort til en pipette, såsom en øjenvipper eller kat whisker, placere orme parallelt forsigtigt skubbe orme i agarose pad. Indtil komfortable med microinjection procedure, kun montere og injicere en orm ad gangen.

Når ormene er på plads og fastgjort til puden, overlejres de med endnu et par dråber halocarbonolie fra spidsen af ormens pluk. Placer dækslet slip med de monterede orme på injektionsmikroskopet. Under en lav forstørrelse skal ormene vinkelret på injektionsnålen, som er fyldt med RNP-opløsningen, som beskrevet i tekstprotokollen.

Skift til en høj forstørrelse, og flyt nålen ved siden af gonadarmen svarende til regionen nær kernerne i midten til slutningen af pachytene. Brug mikromanipulatoren til at flytte nålen mod ormen og tryk neglebåndet lidt. Tryk derefter med den ene hånd på siden af mikroskopstadiet for at ryste nålen gennem neglebåndet. Depress injektionspedalen eller -knappen, fyld langsomt for at gonad arm med injektionsblandingen, og fjern nålen. Gentag trinnet med den anden gonadarm.

Når ormene er injiceret, skal du fjerne coverlip i agarose pad og placere den under en dissekere mikroskop. Ved hjælp af en trukket kapillær pipette, fortrænge olien fra ormene ved pipetter en M9 buffer over dem. Udfør denne behandling for at frigive ormene fra agaren. Efter 10 minutter, når ormene thrashing rundt i bufferen, skal du flytte dem til en NG agar plade med OP50 bakterier ved hjælp af trukket kapillær pipette. Placer pladen ved 20 grader Celsius i to til tre timer, indtil ormene er kommet sig og bevæger sig rundt. Når genvundet, individuelt overføre orme til NG agar plader med OP50 Derefter overføres pladerne til en 25 grader Celsius inkubator.