Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN
La raccolta del sangue è un requisito comune per gli studi di ricerca che coinvolgono topi e ratti. Il metodo di prelievo di sangue nei topi e nei ratti dipende dal volume di sangue necessario, dalla frequenza del campionamento, dallo stato di salute dell’animale da dissanguare e dal livello di abilità del tecnico. 1 Tutti i metodi discussi – sanguinamenti del seno retro-orbitale, sanguinamenti iniziali del cecchino della coda e sanguinamenti intracardiaci – richiedono l’uso di un’anestesia generale.
Prima della procedura di sanguinamento, deve essere determinato il tipo di campione richiesto. Le procedure sperimentali potrebbero richiedere sangue intero, plasma o siero. Per il sangue intero, un anticoagulante deve essere aggiunto al campione. Il plasma, che contiene fibrinogeno e altri fattori di coagulazione quando separato dai globuli rossi, può essere estratto da un campione anticoagulato. Il siero si ottiene attraverso la raccolta del sangue senza un anticoagulante. Il siero risulterà dalla centrifugazione del campione una volta che si è formato un coagulo. Poiché il campione si è coagulato, il siero non conterrà fibrinogeno o altri fattori di coagulazione. Sia il plasma che il siero sono ottenuti attraverso l’uso di una centrifuga a 2200-2500 RPM per un minimo di 15 minuti.
Per un campione che deve produrre sangue intero o plasma, deve essere utilizzato un anticoagulante appropriato. Gli anticoagulanti comunemente usati per gli animali da laboratorio sono eparina, citrato di sodio e acido tetraacetico etilendiammina (EDTA); la cui selezione si basa sulle esigenze di ricerca. Il sequestro, una forma liquida di EDTA, eparina e citrato di sodio, può essere caricato direttamente nella siringa per rivestire le superfici. Ciò consente il contatto dell’anticoagulante direttamente mentre il sangue viene prelevato, aiutando nella prevenzione della coagulazione. Poiché il sangue di ratto coagula più velocemente della maggior parte del sangue dei mammiferi, è essenziale che il corretto rapporto tra anticoagulante e sangue sia utilizzato per la raccolta del sangue.
La selezione dell’ago si basa sulle dimensioni dell’animale e sul sito della venipuntura. In generale, maggiore è il foro dell’ago, più rapidamente il campione può essere raccolto. Meno danni alle cellule del sangue è un altro vantaggio per gli aghi più grandi. Tuttavia, il principale svantaggio degli aghi di grandi dimensioni è il potenziale danno alla nave. Su topi e ratti, le scelte di dimensioni vanno da aghi di calibro 20-29 che sono lunghi 0,5-1,5 pollici. Se un ago è troppo lungo, non solo è scomodo da usare, ma avere lo spazio extra nell’ago potrebbe causare la coagulazione. La dimensione appropriata dell’ago è elencata per ciascun metodo nella sezione procedure.
Anche la dimensione del campione richiesto deve essere predeterminata. A causa delle piccole dimensioni del topo o del ratto, la quantità massima di raccolta di sangue deve essere calcolata per un sanguinamento di sopravvivenza. Un topo medio del peso di 25 grammi ha un volume totale di sangue di 1,8 ml; il ratto medio del peso di 250 grammi ha un volume totale di sangue di 16 ml. Per un singolo campione di sangue su un topo o un ratto senza sostituzione di liquidi, il volume massimo di sangue che può essere rimosso in modo sicuro è del 10% del volume totale del sangue, o 7,7-8 μl / g. Quindi, per un topo medio, il 10% del suo volume di sangue è 193-200 μl. Per un ratto medio di 250 grammi, questo equivale a 1,9-2,0 ml. Gli studi hanno dimostrato che la rimozione di oltre il 15% del volume del sangue può causare shock ipovolemico. 1,2 Tuttavia, con la sostituzione del fluido, è possibile rimuovere fino al 15% del volume totale del sangue, o 12 μl/g. Per un mouse da 25 grammi, questo equivale a 300 μl; per un ratto da 250 grammi, equivale a 3 ml. Per la sostituzione dei liquidi, i fluidi devono essere riscaldati e somministrati per via sottocutanea.
Se è necessario prendere più campioni, il volume del sangue prelevato è ridotto. Il volume massimo di sangue che può essere prelevato a settimana non è superiore al 7,5% del volume ematico totale, o 6 μl/g. Per un topo da 25 grammi, questo equivale a 145-150 μl a settimana. Per un ratto da 250 grammi, questo equivale a 1,45-1,50 ml a settimana. Se il campionamento avverrà ogni 2 settimane, può essere prelevato fino al 10% del volume totale del sangue (8 μl/g). Ciò equivale a 200 μl ogni 2 settimane per un topo medio e fino a 2,00 ml ogni 2 settimane per un ratto da 250 grammi. Uno studio, condotto su ratti con il peso medio di 250 grammi, ha rivelato che quando sono stati rimossi volumi di sangue del 15-20%, ci sono voluti più di 29 giorni perché i livelli ematici si normalizzassero. 1,2 Per la raccolta ripetuta di sangue, la sostituzione del fluido non consente un volume di sangue maggiore o una raccolta di sangue più frequente, in quanto sostituisce solo il volume. L’animale avrà bisogno di tempo per ricostituire le cellule del sangue.
L’uso del plesso retro-orbitale è stata una pratica comune in passato. Tuttavia, sono sorte molte preoccupazioni circa l’umanità di questa procedura. Durante la procedura, un eccessivo movimento del tubo dell’ematocrito una volta posizionato nel canthus mediale dell’occhio può causare danni ai tessuti circostanti, con conseguente gonfiore delle palpebre e / o delle membrane congiuntivali. I tessuti gonfi possono far sporgere il bulbo oculare abbastanza lontano da impedire la chiusura della palpebra, potenzialmente con conseguente essiccazione corneale e danni. Il dolore da gonfiore può innescare graffi e automutilazione che si traduce in enucleazione dell’occhio. Il posizionamento improprio del tubo dell’ematocrito durante un’emorragia retro-orbitale può recidere il nervo ottico, con conseguente cecità. Se il tubo dell’ematocrito è avanzato con un angolo improprio, l’occhio può essere forzato fuori dall’orbita, permettendo alle palpebre di cadere dietro il bulbo oculare. Se ciò si verifica, è molto difficile sostituire correttamente l’occhio nella cavità. Altri problemi che possono sorgere includono la fratturazione delle fragili ossa dell’orbita, la penetrazione del globo oculare che provoca la perdita di umore vitreo o la formazione di un ematoma dietro l’occhio che può causare dolore estremo a causa della pressione sull’occhio e sulle strutture circostanti. Nonostante tutte queste preoccupazioni, se un tecnico esperto esegue la procedura e l’animale è completamente anestetizzato con un anestetico generale, come l’anestesia inalante isoflurano, il sanguinamento retro-orbitale ha dimostrato di essere un metodo efficace di raccolta del sangue nei roditori.
La struttura anatomica dell’area orbitale è diversa tra il topo e il ratto. Il topo ha il seno retro-orbitale, una raccolta di vasi che creano un seno nell’area orbitale. Nell’orbita dell’occhio di ratto, c’è un plesso di vasi che scorrono dietro quell’occhio; tuttavia, non formano un seno, come nel topo. Di conseguenza, è più facile eseguire questa procedura sui topi. Per la raccolta ripetuta del campionamento attraverso il plesso retro-orbitale, è necessario un minimo di 10 giorni tra le emorragie per consentire ai tessuti nell’area di guarire. Sebbene si raccomandi l’anestesia generale, la procedura può essere eseguita nei topi senza anestesia generale se prima della procedura viene applicato un anestetico oftalmico topico, come la proparacaina o la tetracaina. Poiché i ratti non hanno il seno retro-orbitale e poiché le loro membrane intorno all’orbita sono molto più forti, è obbligatorio anestetizzarli per questa procedura.
Campioni seriali di un piccolo volume possono essere ottenuti utilizzando un metodo di clip di coda. L’amputazione iniziale della coda deve essere limitata a una punta della coda, di circa 0,5-1,0 mm di lunghezza nei topi e di 2,0 mm nei ratti. 1 La procedura di taglio della coda per la raccolta del sangue consente la raccolta seriale interrompendo la crosta o il coagulo del taglio originale all’estremità della coda. Generalmente, non è necessaria un’ulteriore amputazione della punta della coda. I volumi di sangue raccolti vanno da 20-100 μL per i topi e 75-150 μL per i ratti. La quantità raccolta è variabile tra gli animali e può essere influenzata dall’età, dallo stato di salute e dal peso.
Il campione raccolto da un cecchino della coda può contenere sia sangue arterioso che venoso, insieme alla contaminazione del prodotto tissutale. La qualità del campione diminuisce se la coda viene accarezzata o “munta” per ottenere più sangue. Per aumentare il flusso sanguigno, la coda può essere riscaldata con impacchi caldi, una lampada di calore o immersione in acqua tiepida. La pressione deve essere applicata alla punta della coda per l’emostasi e gli animali devono essere controllati ogni 5-10 minuti per garantire che l’emostasi sia stata raggiunta. L’emostasi è spesso ritardata con campionamenti ripetuti. Una polvere stiptica può essere utilizzata per l’emostasi. Per l’amputazione iniziale, si raccomanda l’anestesia (generale o locale). Il sanguinamento successivo non dovrebbe richiedere l’anestesia, soprattutto quando gli animali si abituano alla procedura. L’anestesia causerà un calo della pressione sanguigna, rendendo difficile la raccolta del sangue con questa tecnica.
Un’alternativa a un cecchino di coda è il nick della nave di coda. Questa procedura è facilmente eseguibili sia su topi che su ratti. Tuttavia, come con il cecchino della coda, i campioni possono essere contaminati da prodotti tissutali, specialmente nel topo. Per i ratti, un ago ipodermico viene inserito nella nave e il sangue viene raccolto dal mozzo dell’ago. Uno studio ha dimostrato l’uso di un laccio emostatico posto sopra il sito di puntura dell’ago per aiutare nella raccolta del sangue. 3 Una siringa non viene utilizzata per estrarre il sangue dalla nave, poiché la pressione creata dalla siringa farà collassare la nave. Questo metodo può essere utilizzato anche per il campionamento seriale, poiché un coagulo può essere rimosso per far sanguinare nuovamente il sito. Come con i cecchini della coda, è imperativo garantire l’emostasi applicando pressione sul sito e ricontrollando l’animale ogni 5-10 minuti.
Spesso, gli studi richiedono un campione di sangue non vitale e di grandi dimensioni che viene raccolto attraverso il dissanguamento attraverso un sanguinamento intracardiaco o la vena cava caudale. 4 Circa la metà del volume totale del sangue può essere raccolta da un topo o da un ratto mediante puntura cardiaca. Ciò equivale a 40 μl/g o circa 1 ml per un topo medio da 25 grammi. Un ratto da 250 grammi produrrebbe circa 10 ml di sangue. L’animale deve essere anestetizzato per il dissanguamento. L’anestesia inalante o la narcosi CO2 possono essere utilizzate da un tecnico esperto; può anche essere utilizzata l’anestesia iniettabile. Tuttavia, potrebbe esserci una diminuzione della pressione sanguigna e della circolazione, che potrebbe ridurre la quantità di sangue raccolto.
Il metodo della vena cava caudale richiede che l’animale sia profondamente anestetizzato per esporre chirurgicamente la nave. Lanarcosi da CO 2 non è sufficiente, poiché il cuore deve battere e l’animale respirare durante l’astinenza di sangue. Durante la procedura, un prelievo di sangue troppo rapido può causare il collasso del vaso sulla smussatura della siringa, occludendo l’apertura e impedendo la raccolta di sangue. Inoltre, le pareti dei vasi sono sottili e quindi il movimento della mano e dell’ago deve essere evitato per evitare la rottura o la fuoriuscita di sangue dal sito di ingresso dell’ago. Poiché l’ago non passa attraverso la pelle, questo metodo comporta la raccolta di un campione sterile. Devono essere impiegati metodi di eutanasia aggiuntiva per garantire che l’animale non si riprenda dall’anestesia. Questo metodo è spesso seguito da perfusione cardiaca o aortica.
Il metodo intracardiaco può essere eseguito con l’animale trattenuto manualmente una volta anestetizzato (metodo chiuso), oppure il cuore può essere esposto chirurgicamente secondo il protocollo per il metodo di raccolta del sangue della vena cava caudale (metodo aperto). Per il metodo chiuso, i punti di riferimento per il posizionamento dell’ago sono la scanalatura formata dalla gabbia toracica al processo xifoide, sul lato sinistro dell’animale.
Blood collection for mice and rats can be accomplished with a variety of techniques. Although many factors, such as sample size, frequency of sampling, and the size and age of the animal influence this, the most essential component is the skill level of the technician performing the sample collection. For the methods described here, the proper use of anesthetics is also crucial for quality samples and the wellbeing of the animals.
Blood collection is a common requirement for several research studies that involve mice and rats. The choice of method for blood withdrawal in these animals is dependent upon many factors like, the volume of blood needed, frequency of the sampling, health status of the animal to be bled, and the skill level of the technician.
Here, we will review these considerations and outline blood collection procedures including the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection. For other methods, see the second video in this series.
Before delving into the blood withdrawal protocols, let’s first review some general considerations including sample type, needle selection, and the maximum blood volume that can be collected. Prior to collecting blood from a mouse or a rat, the type of blood sample required must be determined. Experimental procedures could require whole blood, plasma, or serum.
If collecting whole blood, an anticoagulant must be added to the sample to prevent clotting. Commonly used anticoagulants include heparin, sodium citrate, and ethylenediamine tetraacetic acid, abbreviated as EDTA. Anticoagulants can be loaded directly into the syringe to coat the surfaces. This allows contact of the anticoagulant directly as the blood is drawn aiding in the prevention of clotting. Because rodent blood clots rapidly, it is essential that the correct ratio of anticoagulant to blood be used. Plasma collection requires centrifuging the whole blood WITH anticoagulant. Following the spin, the translucent liquid above the WBC and platelet layer is plasma. It contains fibrinogen and other clotting factors. On the other hand, serum is collected from whole blood sample WITHOUT anticoagulants. And because the sample has clotted, the serum, which is the top player, does not contain fibrinogen or other clotting factors.
Needle selection is based on the size of the animal and the site of the venipuncture. In general, large bore needles cause less damage to blood cells and enable more rapid blood collection; but are more likely to cause vessel damage. Needle length should also be considered. If a needle is too long, it could be awkward to use, or blood could begin to clot while still inside the needle. The choices of size ranges from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches in length. The appropriate needle size for each method will be discussed in the procedures section.
Lastly, because of the small size of rodents, there is a maximum amount of blood that can be collected from a single blood draw, which will not cause serious harm to the organism. Blood withdrawal could be without or with fluid replacement – usually done using 0.9% physiological saline. The upper limit in each case is listed in the text protocol below. Furthermore, some experiments require multiple sample collection and in such cases along with fluid replacement animal will need time in between to replenish blood cells as well. Again, there is a maximum amount that can be collected during serial collection, and the upper limits are listed in the protocol below.
After reviewing some general considerations, let’s jump into the specific blood withdrawal techniques, starting with retro-orbital bleeding – a technique used by scientists to collect small volumes from the vessels near the eye. Note that the anatomical structure of the orbital area is different between the mouse and rat. The rats have a plexus of vessels that flow behind the eye, whereas the mouse has a collection of vessels that create a retro orbital sinus, which makes it is easier to perform this procedure in mice.
Begin by grabbing a tube for blood collection. Micro hematocrit tubes that hold 50-75 microliters are preferred. Lay down several paper towels or other insulating materials on the work surface. This is to maintain the animal’s body heat during the procedure. Now anesthetize the animal using an inhalation anesthetic such as isoflurane. Once the animal is fully anesthetized, remove it from the chamber and place it down on its side that is in in lateral recumbency position. Next, place a finger on the top of the head and along the jaw line and pull the skin back and down to induce eye protrusion. Avoid applying pressure to the trachea as that may cause death by asphyxia. Subsequently, place the micro-hematocrit tube in the medial canthus of the eye and direct it caudally at a 30 to 45 degree angle from the plane of the nose. Apply pressure while gently rotating the tube. This will cut through the conjunctival membranes and rupture the ocular plexus or sinus. The blood will flow into the hematocrit tube by capillary action. Avoid pushing the tube so deep that you hit the bone at the back of the ocular cavity. Once blood begins to flow, maintain pressure to keep the eye protruded. To stop bleeding, release the skin and allow the eye to return to the normal position. Apply pressure to promote hemostasis. For repeated sample collection, allow a minimum of 10 days between the bleeds. This provides tissues some time to heal.
Although retro-orbital bleeding is a common procedure, there are many concerns about its humaneness. These include swelling due to excessive movement of the hematocrit tube. This in turn can cause the eyeball protrusion and impede closure of the eyelid resulting in corneal drying, damage, and pain, which can trigger scratching and self-mutilation. Improper placement of the hematocrit tube can sever the optic nerve resulting in blindness. Another possible complication is that the eye can be forced out of the orbit, allowing the eyelids to fall behind the eyeball. Furthermore, issues can arise from the fracturing of the fragile orbit bones, penetration of the eye globe resulting in the loss of vitreous humor, or the formation of a hematoma behind the eye that can result in extreme pain. Despite all of these concerns, if a skilled technician performs the procedure and the animal is fully anesthetized, retro-orbital bleeding is an effective method of blood collection in rodents.
Now let’s review the considerations and procedures for tail bleeding, which allows collection of a serial samples of small volumes. The equipment needed for this procedure include a sterile number 11 scalpel. Scissors should not be used because the cut made by scissors is crushing, which can promote clotting and reduce blood flow. Other instruments are a restraint tube that allows access to the animal’s tail; absorbent paper towels; collection or hematocrit tubes and styptic powder – to aid in hemostasis.
Start by securing the animal into the restraint tube. Then, wipe the tail with warm water to remove debris and to cause slight vasodilation. DO NOT use hot water.Extend the tail and with the scalpel blade snip the very end of the tail to collect the blood using hematocrit or collection tubes. The tail can be stroked or “milked” from rump to tip to encourage blood flow. This will, however, decrease the quality of the sample.
To stop bleeding, apply pressure to the tail tip with a gauze pad. The styptic powder may be used to achieve hemostasis. Check the animals every 5 to 10 minutes to ensure hemostasis has been achieved, which might be delayed after repeated sampling. The sample collected from a tail snip can contain both arterial and venous blood, along with tissue product contamination. However, this procedure for blood collection allows for serial collections by disrupting the scab or clot of the original cut at the end of the tail.
An alternative blood collection method to a tail snip is the tail vessel nick, which is relatively less invasive. For this, using the same scalpel blade, make a small cut directly over the lateral tail vein, approximately two-third the distance from the rump. As with tail snips, blood can be collected in collection or hematocrit tubes. And it is imperative to assure hemostasis by applying pressure to the site and rechecking the animal every 5-10 minutes. However, as with the tail snip, the samples may be contaminated with tissue products.
Often studies that require a non-survival large blood sample, which is accomplished through exsanguination via an intra-cardiac bleed or the caudal vena cava.
For intra-cardiac method in mice, you need a 3 cc syringe with a 22 -25 gauge 1 inch needle. And for rats, a 10-12 cc syringe with an 18 gauge 1.5 inches needle is preferred. See the protocol below to understand the why these needs and syringes are ideal.
Start by euthanizing the animal using carbon dioxide. Following euthanasia, hold the rodent by the scruff with the body hanging vertically. This restrain is critical as the body should be straight to prevent deflection of the heart or a twisting of the chest. Note that the heart is located approximately at the level of the elbow. The insertion side is in the notch just to the left of the xiphoid, parallel to the spine and under the ribs.
Insert the needle, bevel up, into the chest and puncture the heart. Apply slight backpressure with the syringe. If the needle is in the heart, blood will flow into the syringe. Wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Approximately half of the total blood volume can be collected from a mouse or rat by cardiac puncture. This is equivalent to approximately 1 mL of blood from an average mouse and approximately 10 mL of blood from an average rat
An alternative position is dorsal recumbency when using the lateral approach. In this case, place the needle between the ribs on the animal’s left side. The point of entry is measured against the point of the elbow on the chest wall. Insert the needle, bevel up, perpendicular to the plane of the table at a point midway on the chest wall. Apply slight back pressure with the syringe. If the needle is in the heart blood will flow into the syringe. Again, wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Note that in either position, excessive backpressure may collapse the heart occluding the needle bevel and stopping blood flow into the syringe.
Another method to collect cardiac blood is through the caudal vena cava. The equipment needed for this procedure are an appropriate syringe with a correct size needle attached; scissors for opening the abdominal cavity, small atraumatic thumb forceps and gauze sponge. This technique requires that the animal be deeply anesthetized and maintained under anesthesia throughout the procedure. CO2 narcosis is not an option, as the animal heart must be beating for this procedure. Place the animal in dorsal recumbency position, and secure the limbs to the platform. The limbs should be extended away from the body.
Now lift the skin with forceps and use scissors to make a small transverse cut through the skin just above the pelvis in females or prepuce in males. Next, place the point of the scissors into the cut and make a midline incision through the skin from the pelvis or prepuce to the xiphoid. With the skin laterally reflected, lift the muscle and make a small transverse cut through the muscle, just above the skin cut.
Place the point of the scissor into the abdomen and make a midline incision through the muscle to the xiphoid. Be sure to angle the scissor point upward to prevent cutting any organs. Cut transversely along the curve of the ribs on each side. Be careful not to puncture the liver. Gently move the intestines to the animal’s left to expose the posterior vena cava. Place a gauze pad on the liver and rest your index and middle fingers on it. With your other hand, insert the needle, bevel up into the vena cava, midway between the junction of the renal vessels and iliac bifurcation. Slowly withdraw the blood while applying pressure on the liver.
Avoid hand movement, as that might cause the vessel rupture. Also, too rapid blood withdrawal can cause the vessel to collapse onto the bevel occluding the opening and preventing blood collection. The main advantage of this technique is the ability to collect a sterile sample because the needle does not pass through the skin.
Lastly, let’s look at some applications of these blood withdrawal techniques. Immuno-oncology is an emerging field, and researchers in this area often perform blood collection to study the immune cells at different stages of cancer development. For example, here researchers collected cardiac blood from cancer-bearing mice to isolate and quantify neutrophils at ten, twenty and thirty days following tumor engraftment.
On the other hand, blood composition is also frequently studied by physiologists. Like in this study, researchers were interested in evaluating kidney function in diabetic animals. In order to do that, these scientists first injected a dye into a diabetes animal model. Next, they then used tail snip method to collect blood at several time-points to evaluate dye concentration in blood, which was ultimately used to calculate glomerular filtration rate that highlighted the difference in kidney function following diabetes induction.
Lastly, stem cells researchers use blood samples to evaluate the success of incorporation of donor cells into the recipient’s system. Here, the investigators first transplanted bone marrow cells from a male mouse into a wild type and genetically modified female animal via the tail vein injection. Next, they collected blood from the retro orbital sinus of the recipient mouse to study the genomic DNA of blood cells using polymerase chain reaction. This provided the percentage of donor cells engraftment in the two types of animals.
You’ve just watched JoVE’s first installment on blood withdrawal techniques. Please see the next video in series to review how to perform other commonly employed techniques of blood collection in lab animals. As always, thanks for watching!
