Calcium beeldvorming van corticale neuronen met behulp van Fura-2 AM
Summary
Calcium-signalen spelen een belangrijke rol in vele cellulaire processen zoals genexpressie, overleving en differentiatie. Hier laten we zien hoe calcium beeldvorming met behulp van Fura-2 AM uit te voeren. Calcium beeldvorming is een waardevol instrument om de regulering van intracellulair calcium in real time en de regulering van de signaaltransductie cascades studie.
Abstract
Calcium beeldvorming is een veelgebruikte techniek die nuttig is voor het meten van calcium signalen in gekweekte cellen. Calcium beeldvormende technieken profiteren van calcium indicator kleurstoffen, die zijn BAPTA op basis van organische moleculen die hun spectrale eigenschappen veranderen als reactie op de binding van Ca2 + ionen. Calcium indicator kleurstoffen vallen in twee categorieën, ratio-metrische kleurstoffen zoals Fura-2 en Indo-1 en single-golflengte kleurstoffen zoals Fluo-4. Ratio-metrische kleurstoffen veranderen ofwel hun excitatie of hun emissie spectra in reactie op calcium, waardoor de concentratie van intracellulair calcium te worden bepaald uit de verhouding van de fluorescentie emissie of excitatie bij verschillende golflengten. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van ratio-metrische kleurstoffen meer dan enkele golflengte probes is dat de verhouding signaal is onafhankelijk van de kleurstof concentratie, lichtintensiteit, en optische weglengte waardoor de concentratie van intracellulair calcium onafhankelijk van deze artefacten worden bepaald. Een van de meest voorkomende calcium indicatoren is Fura-2, die een emissie piek bij 505 nm en verandert de excitatie piek van 340 nm tot 380 nm heeft in reactie op de calcium binding. Hier beschrijven we het gebruik van Fura-2 om intracellulair calcium verhoging te meten in de neuronen en andere exciteerbare cellen.
Protocol
Discussion
In deze presentatie hebben we doorlopen alle stappen voor het uitvoeren van calcium beeldvorming met behulp van Fura-2 AM. We corticale neuronen gebruikt als een model, maar calcium beeldvorming kan worden gebruikt om de intracellulaire calcium te meten in real-time in een verscheidenheid van cellen. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk dat glas dekglaasjes gebruiken in plaats van plastic, want kunststof is vaak TL op ultraviolette golflengten, waardoor beeldvorming moeilijk. Ook is het belangrijk om vooraf de vacht van de dekg…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | EM Science | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | SIGMA | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, . A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, . Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
