Calcium Imaging von kortikalen Neuronen mit Fura-2 AM
Summary
Calcium-Signale eine wichtige Rolle spielen in vielen zellulären Prozessen, einschließlich Genexpression, das Überleben und die Differenzierung. Hier zeigen wir, wie Kalzium-Imaging mit Fura-2 AM durchzuführen. Kalzium-Imaging ist ein wertvolles Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Calcium in Echtzeit und seiner Regulation von Signalkaskaden zu untersuchen.
Abstract
Calcium-Bildgebung ist eine verbreitete Technik, die nützlich für die Messung Calcium-Signale in kultivierten Zellen ist. Kalzium-Imaging-Techniken nutzen Kalzium-Indikator-Farbstoffe, die BAPTA-basierte organische Moleküle, die ihre spektralen Eigenschaften in Reaktion auf die Bindung von Ca2 +-Ionen zu ändern sind. Calcium Indikatorfarbstoffe fallen in zwei Kategorien, ratio-metrischen Farbstoffe wie Fura-2 und Indo-1 und einer einzigen Wellenlänge Farbstoffe wie Fluo-4. Ratio-metrischen Farbstoffe ändern entweder ihre Anregung oder deren Emissionsspektren in Reaktion auf Calcium, so dass die Konzentration der intrazellulären Kalzium aus dem Verhältnis der Fluoreszenz-Emission oder Absorption bei verschiedenen Wellenlängen ermittelt werden. Der Hauptvorteil der Verwendung von ratio-metrischen Farbstoffe über einzelne Wellenlänge Sonden ist, dass das Verhältnis Signal unabhängig von der Farbstoffkonzentration, Beleuchtungsstärke und optische Weglänge ermöglicht die Konzentration der intrazellulären Calcium-unabhängig von dieser Artefakte zu bestimmen ist. Einer der häufigsten Calcium-Indikatoren ist Fura-2, die ein Emissionsmaximum bei 505 nm und ändert seine Anregung Spitzenwert von 340 nm bis 380 nm wurde als Reaktion auf Calcium-Bindung. Hier beschreiben wir die Verwendung von Fura-2 zur intrazellulären Calcium-Erhöhungen in Neuronen und anderen erregbaren Zellen zu messen.
Protocol
Discussion
In dieser Präsentation haben wir alle Schritte für die Durchführung von Kalzium-Imaging mit Fura-2 AM gegangen. Wir verwendeten kortikalen Neuronen als Modell, sondern Kalzium-Imaging kann zur intrazellulären Calcium in Echtzeit gemessen in einer Vielzahl von Zellen sein. Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, Deckgläser statt Kunststoff zu verwenden, da Kunststoff wird häufig fluoreszierende bei ultravioletten Wellenlängen, die Bildgebung erschwert. Auch ist es wichtig, pre-Beschichtung der Deckgläser mit Polyornithin und Lamini…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | EM Science | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | SIGMA | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, . A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, . Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
