Imaging di calcio di neuroni corticali usando Fura-02:00
Summary
Segnali di calcio giocano un ruolo chiave in molti processi cellulari tra cui l'espressione genica, la sopravvivenza e la differenziazione. Qui mostriamo come eseguire l'imaging di calcio con Fura-2 AM. Immagini di calcio è uno strumento prezioso per studiare la regolazione del calcio intracellulare in tempo reale e la sua regolamentazione delle cascate di segnalazione.
Abstract
Immagini di calcio è una tecnica comune che è utile per misurare i segnali di calcio in cellule in coltura. Tecniche di imaging del calcio usufruire di coloranti indicatore di calcio, che sono molecole organiche a base di Bapta che cambiano le loro proprietà spettrali in risposta al legame di ioni Ca2 +. Coloranti indicatore di calcio si dividono in due categorie, rapporto-metrica coloranti come il Fura-2 e Indo-1 e singola lunghezza d'onda coloranti come Fluo-4. Rapporto-metrica coloranti cambiare sia la loro eccitazione o il loro spettri di emissione, in risposta al calcio, permettendo la concentrazione di calcio intracellulare da determinare in base al rapporto di emissione di fluorescenza o eccitazione a lunghezze d'onda diverse. Il principale vantaggio di utilizzare il rapporto-metrico coloranti oltre sonde singola lunghezza d'onda è che il segnale rapporto è indipendente dalla concentrazione di colorante, l'intensità di illuminazione, e la lunghezza del percorso ottico che permette la concentrazione di calcio intracellulare da determinare in modo indipendente di questi manufatti. Uno degli indicatori di calcio più comune è Fura-2, che ha un picco di emissione a 505 nm e cambia il suo picco di eccitazione da 340 nm a 380 nm in risposta al calcio vincolanti. Qui si descrive l'uso di Fura-2 per misurare altezze calcio intracellulare nei neuroni e altre cellule eccitabili.
Protocol
Discussion
In questa presentazione abbiamo superato tutti i passaggi per eseguire l'imaging di calcio con Fura-2 AM. Abbiamo utilizzato i neuroni corticali come modello, ma di imaging calcio può essere utilizzato per misurare intracellulari di calcio in tempo reale in una varietà di cellule. Nel fare questa procedura è importante utilizzare coprioggetto di vetro al posto della plastica, dal momento che la plastica è spesso fluorescente a lunghezze d'onda ultraviolette, il che rende difficile l'imaging. Inoltre, è importante pre-coat i…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | EM Science | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | SIGMA | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, . A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, . Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
