Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm
Summary
Biz toplam iç yansıma ve Epifloresans mikroskopi kullanılarak kültürlü astrositler membran ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın ölçmek için nasıl açıklar.
Abstract
Beyin glial hücreler içerir. Astrositler, glial hücre tipi, uzun nöronlar için pasif bir destekleyici bir rol sağlamak için bilinmektedir. Ancak, artan kanıtlar astrositler nöronlar ile fonksiyonel etkileşim yoluyla da aktif beyin fonksiyonu katılmak olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, birçok temel yönleri astrosit biyoloji, tartışmalı, belirsiz ve / veya deneysel keşfedilmemiş kalır. Bir önemli konu astrositlerde hücre içi kalsiyum Transientlerin dinamikleri. Kalsiyum önemli bir ikinci haberci olarak iyi kurulmuş ve çünkü astrosit kalsiyum yükselmeler astrositler gelen vericileri serbest bırakılması tetikleyebilir ileri sürülmektedir çünkü bu geçerlidir. Ancak, yakın plazma membranı kalsiyum astrositler sinyal herhangi bir ayrıntılı ve tatmin edici bir açıklama olmamıştır. Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi canlı hücrelerinin plazma membranı yaklaşık 100 nm içinde önemli fizyolojik sinyalleme olaylarını analiz etmek için güçlü bir araçtır. Burada, TIRF mikroskobu kullanımı ve neredeyse aynı anda, plazma membranı ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın izlemek nasıl tarif. Bu yaklaşımın daha rafine ve sistematik bir uygulama astrosit kalsiyum sinyal kesin detaylar hakkında bilgi potansiyeline sahiptir. Astrosit kalsiyum dinamiklerinin ayrıntılı bir anlayış, nasıl, ne zaman ve neden astrositler ve nöron kalsiyum-bağımlı fonksiyonel etkileşimleri tabi anlamak için bir temel sağlayabilir.
Protocol
Discussion
Astrositler hücre içi kalsiyum yükselmeler görüntüler çok iyi kurulmuştur. Bu, kendiliğinden meydana gelen nöronal aktivite veya 11 astrosit yüzey reseptörleri aktive agonistleri uygulama tarafından tetiklenebilir. Bir önemli ve tartışmalı bir konu olmadığını astrosit hücre içi kalsiyum yükselmeleri, nöronlar 11, 12 reseptörleri aktive sinyal molekülleri serbest bırakılması tetikleyebilir. Yorum Haydon 7, 13 ve McCarthy 11 laboratuvarları tarafından vurgulanan bu g?…
Acknowledgements
Bu çalışma, Japonya Uehara Memorial Foundation (ES) yanı sıra Whitehall Vakfı, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme ve Stein-Oppenheimer Endowment Ödülü (BSK) Enstitüsü tarafından desteklendi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargille | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | WARNER Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | WARNER Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
