Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten
Summary
Wir beschreiben, wie man in der Nähe Membran und globalen intrazellulären Calcium-Dynamik in kultivierten Astrozyten mit Totalreflexion und Epifluoreszenzmikroskopie messen.
Abstract
Das Gehirn enthält Gliazellen. Astrozyten, eine Art von Gliazellen, sind seit langem bekannt, eine passive unterstützende Rolle zu Neuronen liefern. Allerdings schlägt immer deutlicher, dass Astrozyten kann auch aktiv in die Gehirnfunktion zu beteiligen durch funktionelle Interaktionen mit Neuronen. Allerdings bleiben viele grundlegende Aspekte der Astrozyten Biologie umstritten, unklar und / oder experimentell erforscht. Ein wichtiges Thema ist die Dynamik der intrazellulären Calcium-Transienten in Astrozyten. Dies ist relevant, weil Kalzium ist auch eine wichtige second messenger gegründet und weil es wurde vorgeschlagen, dass Astrozyten Kalzium Erhebungen können die Freisetzung von Transmittern aus Astrozyten auslösen. Allerdings gibt es keine detaillierte oder befriedigende Beschreibung der in der Nähe Plasmamembran Calcium-Signalgebung in Astrozyten wurden. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um physiologisch relevante Signalwege innerhalb von etwa 100 nm der Plasmamembran von lebenden Zellen zu analysieren. Hier verwenden wir TIRF-Mikroskopie und beschreiben, wie man in der Nähe Plasmamembran und globale intrazellulären Calcium-Dynamik fast gleichzeitig zu überwachen. Die weitere Verfeinerung und systematische Anwendung dieses Ansatzes hat das Potenzial, über die genauen Details der Astrozyten Calcium-Signalgebung zu informieren. Ein detailliertes Verständnis der Astrozyten Calcium-Dynamik kann eine Grundlage zu verstehen, wenn, wie, wann und warum Astrozyten und Neuronen durchlaufen eine Calcium-abhängigen funktionellen Interaktionen.
Protocol
Discussion
Es ist gut etabliert, dass Astrozyten intrazellulären Calcium-Erhebungen angezeigt. Diese spontan auftreten, kann durch neuronale Aktivität oder durch die Anwendung von Agonisten an Rezeptoren auf der Oberfläche 11 Astrozyten aktivieren ausgelöst werden. Eine wichtige und umstrittene Frage ist, ob Astrozyten intrazellulären Calcium-Erhebungen können die Freisetzung von Signalmolekülen, die Rezeptoren aktivieren auf Neuronen 11, 12 auslösen. Dies ist umstritten, weil es Beweise für und gegen diese Ansicht, wie …
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Uehara Memorial Foundation of Japan (ES) sowie die Whitehall-Stiftung, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke und ein Stein-Oppenheimer Endowment Award (für BSK) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargille | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | WARNER Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | WARNER Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
