공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브
Summary
이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.
Abstract
이 비디오에서는, 우리는 우리의 실험실은 개발 zebrafish의 두뇌 (구츠맨 외, 2008)를 구부, 접이식하는 데 필요한 세포 모양 변경 및 rearrangements을 분석하기 위해 개발한 방법을 보여줍니다. 이러한 분석은 척추 두뇌의 3D 구조의 개발에 필요한 기본 세포 생물학의 새로운 이해를 내실수하고, 크게 신경 튜브 morphogenesis를 공부하는 능력을 증가시킵니다. 배아 zebrafish 두뇌는 neuroepithelium가 급증 내에 심실로 18시간 포스트 수정 (HPF)에서 시작 모양이다. 24 HPF으로 신경 튜브 morphogenesis의 초기 단계를 완료합니다. 방법을 사용하면 여기에 설명 한 세포 단계에서 배아는 mRNA 인코딩 막 타겟 녹색 형광 단백질 (memGFP)로 주입됩니다. 주입과 부화, 배아, 18 사이의 24 HPF 후, 아가로 오스에 거꾸로, 장착하고 공촛점 현미경으로 몇 군데. 특히, zebrafish 배아는 형광 이미징을위한 이상적인 시스템을 만들어 투명합니다. 우리의 분석은 midbrain – hindbrain 경계와 hindbrain에 초점을 가지고 있지만,이 방법은 80-100 μm의 깊이에 zebrafish에서 지역의 분석을 위해 연장 수 있습니다.
Protocol
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 단세포 zebrafish의 배아에 mRNA 분사하는 방법을 보여줍니다. 여기서는 각 셀에 레이블을 막 타겟 GFP를 인코딩 mRNA를 사용합니다. 그러면 단일 셀 해상도에서 개발 두뇌를 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 midbrain – hindbrain 경계의 형성 (구츠맨 외, 2008)에 필요한 세포 모양의 변화의 소설 유형, 기초 수축을 공부하고있었습니다. 다른 현상과 마찬가?…
Acknowledgements
처음 Sive 연구실에서이 기술을 개발 박사 제니퍼 구츠맨 많은 감사드립니다. 친절 플라스미드 인코딩 CAAX – GFP의 mRNA를 제공 데이나 파버 암 연구소 – 보스턴, MA에서도 JB 그린 감사합니다. 공촛점 이미지는 화이트 헤드의 WM 켁 재단 생물 이미징 시설에서 실시되었다. HS는 NIHMH70926에 의해 지원됩니다. EG는 NSF 미리 박사 친교에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
