فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم
Summary
وصف لطريقة التي يسببها الفيروس الجين (VIGS) لإسكات أسفل طرق التعبير الجيني في<em> نيكوتيانا benthamiana</em> والطماطم.
Abstract
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هي محددة للغاية إسكات الجينات الظاهرة سببها الرنا المزدوج الجديلة 1. هذه الآلية إسكات يستخدم اثنين من الفئات الكبرى من المنظمين RNA : microRNAs ، والتي يتم إنتاجها من البروتين غير ترميز الجينات وقصيرة الرناوات التدخل (siRNAs). استخدام النباتات لمكافحة رني ترانسبوزونات وممارسة رقابة مشددة على عمليات التنمية مثل تشكيل هيئة زهرة نبات 2،3،4 والتنمية. النباتات أيضا استخدام رني للدفاع عن أنفسهم ضد عدوى الفيروسات. وبالتالي ، تطورت العديد من الفيروسات المكثفات من إسكات جينات للسماح بنجاح استعمارها المضيفة 5.
فيروس من صنع إسكات الجينات (VIGS) هو الأسلوب الذي يستفيد من رني بوساطة محطة الآلية الدفاعية المضادة للفيروسات. في النباتات المصابة بفيروسات معدلة وتستهدف على وجه التحديد آلية ضد الجينوم الفيروسي. ومع ذلك ، مع ناقلات تحمل الفيروس تسلسل الجينات المستمدة من المضيف ، ويمكن بالإضافة إلى ذلك استهدفت عملية ضد mRNAs المضيف المطابق. وقد تم تكييفها لVIGS عالية الإنتاجية الجينوميات الوظيفية في النباتات باستخدام محطة الممرض المورمة الأجرعية لتسليم عبر تي في البلازميد ، وهو فيروس المؤتلف تحمل كامل أو جزء من تسلسل الجينات المستهدفة لإسكات. النظامية انتشار الفيروس وآلات مصنع الذاتية رني رعاية بقية. ويتم إنتاج dsRNAs المقابلة لهدف والجينات المشقوق ثم بواسطة المقامر ريبونوكلياز في siRNAs من 21-24 النيوكليوتيدات في الطول. هذه النهاية siRNAs دليل الحمض النووي الريبي التي يسببها إسكات المعقدة (RISC) أن تتحلل نص الهدف 2.
وقد استخدمت ناقلات مختلفة في VIGS ويستند واحدة من أكثر استخداما على التبغ حشرجة فيروس (TRV). TRV هو فيروس الثنائية ، وكما ألف اثنين من الممثلين ، ومختلف تستخدم سلالات المورمة لVIGS. واحد يحمل pTRV1 ، الذي يشفر وظائف النسخ والحركة الفيروسية في حين أن الآخر ، pTRV2 والموانئ معطف البروتين وتسلسل المستخدمة لVIGS 6،7. تلقيح benthamiana نيكوتيانا وشتلات الطماطم مع خليط من سلالات النتائج سواء في إسكات الجينات. يستخدم إسكات الجين phytoene الذاتية (PDS) desaturase ، والذي يسبب photobleaching ، بوصفها لمراقبة كفاءة VIGS. وتجدر الإشارة إلى أنه ، مع ذلك ، أن إسكات في الطماطم هي عادة أقل كفاءة مما كان عليه في N. benthamiana. وينبغي دائما RNA فرة نسخة من هذا الجين من الفائدة يمكن قياسها للتأكد من أن الجينات المستهدفة أسفل تم بكفاءة التنظيم. ومع ذلك ، تسلسل الجينات غيري من N. يمكن أن تستخدم لإسكات benthamiana orthologs كل منهما في الطماطم ، والعكس بالعكس 8.
Protocol
Discussion
فيروس من صنع إسكات الجين هو الأسلوب الذي يسمح السريع شاشات الجينية العكسية. انها تتجنب توليد T – DNA أو الجينات بوساطة ينقول تدق الرافضة ، والتي لا تتوفر إلا في بعض النباتات مثل الذرة وArabidopsis. انها تلتف أيضا عملية تستغرق وقتا طويلا لتحويل النباتات ويسمح للاستهداف ج?…
Acknowledgements
نشكر الدكتورة باتريشيا Manosalva لرؤى لها قيمة على المخطوطة. تم توفير التمويل من قبل البرنامج الوطني لمؤسسة العلوم النباتية الجينوم ، وعدد الجوائز DBI – 0605059.
References
- Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet. 17, 449-459 (2001).
- Carrington, J. C., Ambros, V. Role of microRNAs in plant and animal development. Science. 301, 336-338 (2003).
- Chen, X. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science. 303, 2022-2025 (2004).
- Palatnik, J. F. Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature. 425, 257-263 (2003).
- Brigneti, G. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant Journal. 31, 777-786 (2002).
- MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).
- Senthil-Kumar, M. A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing. New Phytol. 176, 782-791 (2007).
- McCullen, C. A., Binns, A. N. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 101-127 (2006).
- Rosebrock, T. R. A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity. Nature. 448, 370-374 (2007).
- Miki, D., Itoh, R., Shimamoto, K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice. Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).
- Voinnet, O. Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants. Trends Plant Sci. 13, 317-328 (2008).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Kumar-Dinesh, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Liu, E., Page, J. E. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant. Methods. 4, 5-5 (2008).
