Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) em Nicotiana benthamiana Tomate e

Summary

Descrição de um vírus induzida silenciamento de genes método (VIGS) para knock-down da expressão gênica em<em> Nicotiana benthamiana</em> E tomate.

Abstract

Interferência de RNA (RNAi) é um fenômeno altamente específico gene silenciando-desencadeada por dsRNA ^1. Este mecanismo de silenciamento usa duas classes principais de reguladores de RNA: microRNAs, que são produzidos a partir de proteínas não-genes que codificam e curto RNAs de interferência (siRNAs). As plantas usam RNAi para controle transposons e exercer um controlo apertado sobre os processos de desenvolvimento como a formação de órgãos florais e desenvolvimento de folhas ^2,3,4. Plantas também usar RNAi para se defender contra a infecção por vírus. Conseqüentemente, muitos vírus evoluíram de silenciamento de genes supressores de permitir sua colonização bem sucedida de seu hospedeiro ^5.

Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) é um método que aproveita o mecanismo de defesa das plantas RNAi mediada antiviral. Em plantas infectadas com o vírus modificado o mecanismo é especificamente dirigidas contra o genoma viral. No entanto, com vetores de vírus carregando seqüências derivadas de genes do hospedeiro, o processo pode ser adicionalmente dirigidas contra o mRNAs de host correspondente. VIGS foi adaptado para high-throughput genômica funcional em plantas usando a planta patógeno Agrobacterium tumefaciens para oferecer, através da sua Ti plasmídeo, um vírus recombinante carregando toda ou parte da seqüência do gene alvo para silenciar. Propagação do vírus sistêmico e endógeno plantas RNAi máquinas cuidar do resto. dsRNAs correspondente ao gene-alvo são produzidas e depois clivado pela Dicer ribonuclease em siRNAs de 21 a 24 nucleotídeos de comprimento. Estes siRNAs em última análise, orientar a RNA induzida silenciamento complexos (RISC) para degradar a transcrição alvo ^2.

Diferentes vetores têm sido empregadas em VIGS e um dos mais utilizados é baseado em tabaco rattle vírus (TRV). TRV é um vírus bipartido e, como tal, A. dois diferentes cepas tumefaciens são usados ​​para VIGS. Um carrega pTRV1, que codifica as funções de replicação e movimento viral, enquanto o outro, pTRV2, abriga a capa protéica ea seqüência utilizada para VIGS ^6,7. Nicotiana benthamiana inoculação de mudas de tomate e com uma mistura de ambas as linhagens resultados no silenciamento gênico. Silenciamento do gene endógeno fitoeno desaturase (PDS), que causa fotobranqueamento, é usado como um controle para a eficiência VIGS. Deve-se notar, no entanto, que o silenciamento em tomate é normalmente menos eficiente do que em N. benthamiana. RNA abundância transcrição do gene de interesse deve ser sempre medida para garantir que o gene-alvo tem sido eficiente para baixo-regulado. No entanto, seqüências de genes heterólogos a partir de N. benthamiana podem ser usadas para silenciar seus respectivos ortólogos no tomate e vice-versa ^8.

Protocol

Parte 1: O material vegetal N. benthamiana plantas usadas para silenciar deve ser em torno de 2 ½ semanas de idade que é o momento em que os cotilédones e os primeiros 2 – 4 folhas verdadeiras têm surgido. Tomate (Solanum lycopersicum) plantas são usadas 7-8 dias pós-emergência, quando as folhas verdade ainda não apareceu. Parte 2: VIGS DIA 1 Para cada experimento, Agrobacterium tumefaciens abr…

Discussion

Induzida por vírus silenciamento do gene é um método que permite rápida reverter telas genética. Ele evita a geração de T-DNA ou gene mediada transposon knock-outs, que só estão disponíveis em certas plantas, como Arabidopsis e de milho. Ele também contorna o processo demorado de transformação de plantas e permite o direcionamento de múltiplos genes, ao mesmo tempo, desde que tenham ¹⁰ ou homologia suficiente que as seqüências alvo diferentes de acolhimento são dispostos em tandem no…