سريع والحساسة صمغي Coomassie G - 250 لتلطيخ البروتينات في الهلام بولي أكريلاميد
Summary
يجب نشر هذا الفيديو الغروية Coomassie a G – 250 وفقا لبروتوكول تلطيخ كانغ<em> وآخرون.</em> للكشف عن البروتين متوسط 4 نانوغرام في المواد الهلامية. اكتمال التلوين في حدود 2 ساعة ، ودون أي جهد. نستخدم عادة بروتوكول كانغ للأغراض التحليلية في جل المستندة البروتيوميات.
Abstract
Coomassie بريليانت الأزرق (المصرف المركزي) هو صبغ يشيع استخدامها لتصور للبروتينات مفصولة SDS – PAGE ، وتقدم على إجراء تلوين بسيطة والكميات العالية. وعلاوة على ذلك ، وهو متوافق تماما مع الكتلة الطيفي تحديد البروتين. لكن على الرغم من هذه المزايا ، يعتبر المصرف المركزي إلى أن تكون أقل حساسية من الفضة أو stainings مضان ، وبالتالي نادرا ما تستخدم للكشف عن البروتينات في النهج التحليلي القائم على البروتين هلام.
أدخلت تحسينات عديدة من 1 أصلية Coomassie بروتوكول لزيادة حساسية المصرف المركزي. تطبيق Neuhoff وزملاؤه في عام 1988 ، والميثانول بنسبة 20 ٪ وتركيزات أعلى من كبريتات الامونيوم في G – 250 المصرف المركزي حل يستند تلطيخ 2 : أدخلت تعديلين رئيسية لتعزيز الكشف عن البروتينات المنخفضة وفيرة عن طريق تحويل الجزيئات إلى جزيئات صبغة الغروية وفي عام 2004 آخرون Candiano. أنشئ المصرف المركزي باستخدام الأزرق الفضي G – 250 مع حامض الفوسفوريك في وجود كبريتات الامونيوم والميثانول 3. ومع ذلك ، فإن جميع هذه التعديلات تسمح فقط للكشف عن البروتين حوالي 10 نانوغرام. ونشرت على نطاق واسع لبروتوكول fameless تلطيخ Coomassie الغروية التي كانغ وآخرون في عام 2002 حيث تعديل Neuhoff تلوين المصرف المركزي الغروية بروتوكول بشأن المواد complexing. بدلا من كبريتات الامونيوم سلفات الألمنيوم استخدامها واستعيض الميثانول من 4 الإيثانول أقل سمية. وأظهرت القائمة على الألمنيوم في دراسة الرواية تلوين كانغ الحساسية الفائقة التي يكشف منخفضة مثل 1 نانوغرام / فرقة (فسفوريلاز ب) مع قليل من الاختلاف حساسية اعتمادا على البروتينات.
هنا ، علينا أن نظهر تطبيق بروتوكول كانغ لسريع وحساسة تلطيخ Coomassie الغروية من البروتينات في أغراض التحليلية. وسوف نوضح بروتوكول سريعة وسهلة باستخدام ثنائية الأبعاد المواد الهلامية بصورة روتينية في مجموعتنا العمل.
Protocol
Discussion
الابتكارية أو مجرد بروتوكول Coomassie؟
في هذه اللحظة توجد بروتوكولات متعددة لتلطيخ الاجراءات مع Coomassie بريليانت الأزرق. معظمهم نتيجة تعديلات طفيفة أو كبيرة واحدة من البروتوكولات الأكثر استخداما من قبل الزملاء وNeuhoff 2. أيضا بروت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور نقولا Wiethölter لإعداد وتلون 1 مد المواد الهلامية.
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة مقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (GRK 1089/project 5 إلى ND وSM) وبدعم من منحة بحثية من Manchot يورغن شتيفتونغ لND.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
