Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide
Summary
Cette vidéo est de populariser une colloïdale Coomassie G-250 protocole de coloration en fonction de Kang<em> Et al.</em> Pour la détection de protéines moyenne 4 ng dans les gels. La coloration est terminé dans les 2 heures et sans aucun effort. Nous utilisons régulièrement le protocole de Kang des fins d'analyse en gel à base de protéomique.
Abstract
Coomassie Brilliant Blue (CBB) est un colorant couramment utilisé pour la visualisation des protéines séparées par SDS-PAGE, offrant une procédure de coloration simple et quantification élevée. Par ailleurs, il est totalement compatible avec l'identification des protéines par spectrométrie de masse. Mais malgré ces avantages, CBB est considéré comme moins sensible que d'argent ou de colorations fluorescence et donc rarement utilisés pour la détection des protéines dans les approches protéomiques analytiques à base de gel.
Plusieurs améliorations de l'original du protocole 1 de Coomassie ont été faits pour augmenter la sensibilité de la CBB. Deux modifications majeures ont été introduites pour améliorer la détection de protéines de faible abondance par la conversion des molécules de colorant dans les particules colloïdales: En 1988, Neuhoff et ses collègues ont utilisé 20% de méthanol et de plus fortes concentrations de sulfate d'ammonium dans le CBB G-250 une solution de coloration basée 2, et en 2004, al Candiano et al. établie Blue Silver utilisant CBB G-250 avec de l'acide phosphorique en présence de sulfate d'ammonium et de méthanol 3. Néanmoins, toutes ces modifications permettent simplement une détection d'environ 10 ng de protéines. Un protocole largement fameless pour Coomassie coloration colloïdale a été publié par Kang et al. En 2002 où ils ont modifié le protocole Neuhoff colloïdale coloration CBB concernant les substances complexantes. Au lieu de sulfate d'ammonium ils ont utilisé du sulfate d'aluminium et de méthanol a été remplacé par le 4 éthanol moins toxiques. La base d'aluminium dans l'étude de nouvelles taches de Kang a montré une sensibilité supérieure, qui détecte aussi bas que 1 ng / bande (phosphorylase b) avec une variation peu de sensibilité en fonction des protéines.
Ici, nous démontrons l'application du protocole de Kang rapide et sensible pour la coloration de Coomassie colloïdal de protéines à des fins analytiques. Nous allons illustrer le protocole rapide et facile en utilisant des gels bidimensionnels en routine dans notre groupe de travail.
Protocol
Discussion
Innovants ou tout simplement un autre protocole de Coomassie?
À l'heure actuelle, il existe plusieurs protocoles pour les procédures de coloration de Coomassie Brilliant Blue. La plupart d'entre eux résultent de modifications mineures ou majeures de l'un des protocoles les plus couramment utilisés par les Neuhoff et ses collègues 2. Aussi le protocole Kang est basé sur la formule de Neuhoff. Mais est-ce vraiment une méthode de coloration au bleu de Coomassie alt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Nicola Wiethölter de la préparation et la coloration de 1 D-gels.
Ce travail a été financé par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 à ND et SM) et soutenu par une bourse de recherche de l'Manchot Jürgen Stiftung à ND.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
