Snabb och känslig Kolloidal Coomassie G-250 Färgning för proteiner i polyakrylamidgeler
Summary
Denna video ska popularisera en kolloidal Coomassie G-250 färgningsprotokollet enligt Kang<em> Et al.</em> För upptäckt av genomsnitt 4 ng protein i geler. Färgningen är klar inom 2 timmar och utan ansträngning. Vi använder rutinmässigt Kangs protokoll för analytiska ändamål i gel-baserad proteomik.
Abstract
Coomassie Brilliant Blue (CBB) är ett färgämne som ofta används för visualisering av proteiner separeras med SDS-PAGE, som erbjuder ett enkelt färgningsproceduren och hög kvantifiering. Dessutom är det helt kompatibelt med masspektrometrisk protein identifiering. Men trots dessa fördelar är CBB anses vara mindre känsliga än silver eller fluorescens stainings och därför sällan används för detektion av proteiner i analytisk gel-baserad proteomik strategier.
Flera förbättringar av den ursprungliga Coomassie protokoll 1 har gjorts för att öka känsligheten för CBB. Två större förändringar infördes för att förbättra upptäckten av låga rikliga proteiner genom att konvertera färgen molekyler i kolloidala partiklar: År 1988 tillämpade Neuhoff och kollegor 20% metanol och högre halter av ammonium sulfat i CBB G-250 baserad färglösning 2, och 2004 Candiano et al. etablerade Blå Silver med CBB G-250 med fosforsyra i närvaro av ammoniumsulfat och metanol 3. Trots alla dessa ändringar kan bara en upptäckt av cirka 10 ng protein. En allmänt fameless protokoll för kolloidala Coomassie färgning publicerades av Kang et al. År 2002 där de ändrade Neuhoff är kolloidal protokoll CBB färgning om komplexbildande ämnen. Istället för ammoniumsulfat de använde aluminiumsulfat och metanol ersattes av den mindre giftiga etanol 4. Den nya aluminium-baserade färgning i Kangs studie visade överlägsen känslighet som upptäcker så lågt som 1 ng / bandet (phosphorylase b) med liten känslighet varierar beroende på proteiner.
Här visar vi tillämpa Kangs protokoll för snabba och känsliga kolloidala Coomassie färgning av proteinerna i analytiska ändamål. Vi kommer att illustrera den snabba och enkla protokoll med hjälp av tvådimensionella geler rutinmässigt i vår arbetsgrupp.
Protocol
Discussion
Innovativ eller bara en annan Coomassie protokoll?
Just nu finns det flera protokoll för färgning förfaranden Coomassie Brilliant Blue. De flesta av dem beror på mindre eller större ändringar av ett av de vanligaste protokollen som Neuhoff och kollegor 2. Även Kangs protokoll baserat på Neuhoff formel. Men är det verkligen ett alternativ Coomassie färgning metod för proteomik forskning? Vi kommer bild två huvudfrågor, detektionsgräns och användbarhet, till bevis att…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Nicola Wiethölter för att förbereda och färgning av 1-D gel.
Detta arbete har finansierats av ett stipendium från Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 till ND och SM) och stöds av ett forsknings-stipendium från Jürgen Manchot Stiftung till ND.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
