Denaturering Urea polyakrylamidgelelektrofores (urea SIDA)
Summary
Denaturering urea polyakrylamidgelelektrofores används för att separera enda DNA eller RNA upp till en gräns på 500 nukleotider. Urea i kombination med värme denaturerar prover och ostrukturerade enstaka delar migrera inom gelmatrisen enligt deras molekylvikt.
Abstract
Urea sida eller denaturering urea elektrofores polyakrylamidgel sysselsätter 6-8 M urea, som denaturerar sekundära DNA eller RNA strukturer och används för deras separation i en polyakrylamidgel matris baserad på molekylvikt. Fragment mellan 2 till 500 baser, med längd så små som en enda nukleotid, kan separeras med denna metod 1. Migreringen av provet är beroende av den valda akrylamid koncentration. En högre andel av polyakrylamid beslutar lägre molekylvikt fragment. Kombinationen av urea och temperaturer på 45-55 ° C under gelen köra möjliggör separation av ostrukturerade DNA eller RNA-molekyler.
I allmänhet denna metod krävs för att analysera eller rena enstaka DNA eller RNA fragment, som syntetiserade eller märkta oligonukleotider eller produkter från enzymatisk klyvning reaktioner.
I denna video artikeln visar vi hur du förbereder och kör denaturering gel urea polyakrylamid. Tekniska tips ingår, i tillägg till det ursprungliga protokollet 1,2.
Protocol
Discussion
- Bandet skärpa beror på flera faktorer. Provmängden lastas för skarpa band bör vara så liten som möjligt, dvs helst mellan 1-5 l. Däremot kan upp till 15 l laddas som fortfarande garanterar godtagbar lösning. Mindre provvolym ger skarpare band.
- Bandet kvalitet är också beroende av gelen tjocklek. Tunnare gel, till exempel 0,75 mm visar bättre resultat än 1,5 mm tjock geler.
- Formen på band kan även påverkas under gel lastning, om provet inte tillämpas lika i gelen fickan. Inklusive 10% glycerol i buff…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Singapores Academic Research Council (ARC) [licensnummer 90/07]. Vi tackar Radiodurans för stödet.
References
- Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochimie. 14, 3787-3794 (1975).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. , (2001).
- . . PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual. , (2001).
