تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم
Summary
نحن هنا لشرح البروتوكولات لأداء المفرد جزيء مضان المجهري على الخلايا البكتيرية الحية للتمكن من الكشف عن مجمعات الجزيئية وظيفية ، ومجنزرة كميا.
Abstract
ويمكن تحقيق الرؤية الكاملة في آليات الخلايا الحية فقط من خلال التحقيق في العمليات الرئيسية والمباشرة التي تثير الأحداث على المستوى الخلوي. إلى تاريخ القص تعقيد النظم البيولوجية تسبب دقيقة واحدة جزيء التجارب لتكون بعيدة جدا يطالبون ، والتركيز بدلا من ذلك على دراسة النظم واحد باستخدام معظم الخام نسبيا الفرقة المتوسط القياسات. ومع ذلك ، العديد من العمليات الهامة تحدث في الخلية الحية على مستوى واحد فقط أو جزيئات قليلة ؛ القياسات فرقة القناع عموما الطبيعة العشوائية وغير المتجانسة من هذه الأحداث. هنا ، وذلك باستخدام المجهر الضوئي المتطورة والأدوات التحليلية لتحليل الصور ونحن لشرح كيفية رصد البروتينات داخل الخلية الحية واحد البكتيرية إلى دقة واحدة من الجزيئات ، وكيف يمكننا مراقبة ديناميكية داخل مجمعات الجزيئية في أداء الأجهزة البيولوجية. التقنيات ذات الصلة مباشرة من الناحية الفسيولوجية. فهي طفيفة ، perturbative وغير الغازية لعينة بيولوجية هي قيد الدراسة ومتفهمين تماما عن التحقيقات في المادة الحية ، وميزات لا تتوافر لنهج واحد جزيء آخر من الفيزياء الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، درس جميع العينات البيولوجية إنتاج البروتين fluorescently الموسومة على المستويات التي تكاد تكون متطابقة مع سلالات خلايا معدلة ("ترميز الجينومية") ، على عكس النهج الأكثر شيوعا ولكن أقل مثالية لتوليد البروتين أكثر بكثير مما يمكن أن يحدث بشكل طبيعي ('التعبير البلازميد"). وبالتالي ، فإن العينات البيولوجية الفعلية التي سيتم التحقيق فيها هي أقرب إلى حد كبير في الكائنات الطبيعية ، وبالتالي المزيد من الملاحظات ذات الصلة على العمليات الفيزيولوجية الحقيقية.
Protocol
Discussion
ويجب الحرص على عدم "على القص" خلية للنظر في البكتيريا المربوطة ، لأن ذلك قد يضعف من وظيفة المحركات سوطي. من المهم أن استخدام الخلايا لفترة أطول من ساعة مرة واحدة على شريحة المجهر لأنها قد تصبح الأوكسجين المستنفد. قد تكون هناك حاجة كبيرة الأمثل للعثور على أفضل مجه?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف ان التبرعات العينية من سلالات بكتيرية من المجموعات البروفيسور جوديث ارميتاج (جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة) والبروفيسور كونراد Mullineaux (جامعة كوين ماري في لندن ، المملكة المتحدة). ويتم تمويل مشترك من جانب IMD قسم الكيمياء الحيوية (جامعة أكسفورد) وOCISB ؛ وتمول من قبل AR الهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EPSRC) DTC دراسية ل؛ يمول ND من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC) ؛ هو MCL بتمويل من زمالة الجمعية الملكية للبحوث الجامعة.
References
- Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
- Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).
- Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay. Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).
- Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay. FEBS Lett. , 535-555 (2003).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane. Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane. Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli. Biophys. 93, 294-302 (2007).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells. Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).
