כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.
Abstract
התובנה המלאה לתוך המנגנונים של תאים חיים יכולה להיות מושגת רק על ידי חוקר את תהליכי המפתח לעורר ולכוון אירועים ברמה התאית. עד כה מורכבות גזירה של מערכות ביולוגיות גרמה ניסויים מדויקים מולקולה בודדת להיות תובעני מדי, במקום התמקדות במחקרים של מערכות יחיד באמצעות בתפזורת גולמי יחסית ההרכב הממוצע מדידות. עם זאת, תהליכים חשובים רבים המתרחשים בתא החי ברמה של רק אחת או כמה מולקולות; מדידות ההרכב כלל להסוות את טבעו סטוכסטיים והטרוגניות של אירועים אלה. כאן, בעזרת מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת כלי ניתוח אנליטיים תמונה אנחנו מדגימים כיצד לפקח חלבונים בתוך תא חי בודד החיידק עד לדיוק של מולקולות בודדות וכיצד אנו יכולים לצפות הדינמיקה בתוך קומפלקסים מולקולריים בתפקוד מכונות ביולוגיות. טכניקות רלוונטיים ישירות פיזיולוגית. הם מינימלית perturbative ולא פולשנית המדגם ביולוגי תחת לימוד מכוונים באופן מלא בחקירות בחומר חי, תכונות לא זמינים מולקולה בודדת גישות אחרות של ביופיזיקה. בנוסף, דגימות ביולוגיות למד לייצר כל חלבון fluorescently-tagged ברמות אשר כמעט זהים לצלילי תא ללא שינוי ("הקידוד הגנומי"), בניגוד לגישה נפוצה יותר אך פחות אידיאלי להפקת חלבון משמעותי יותר היה להתרחש באופן טבעי ('פלסמיד ביטוי "). לפיכך, בפועל דגימות ביולוגיות אשר תיחקר באופן משמעותי קרוב יותר אורגניזמים טבעיים, ולכן התצפיות רלוונטי יותר תהליכים פיזיולוגיים אמיתי.
Protocol
כדי להתחיל בהליך זה, 50 μl של מניות קפוא של חלבון פלואורסצנטי להביע coli Escherichia תאים חיידקיים הם מפשיר הראשון גדלו aerobically עם רועד 5 מ"ל LB התקשורת צמיחה לילה ב 37 מעלות צלסיוס בבוקר, 50 μl של תרבות זו רווי מופק ותת תרבות מינימלית M63 לתוך תרבות מדיה גלוקוז, דו?…
Discussion
יש להקפיד שלא "על גזירה" התא מסתכל חיידקים קשור, שכן הדבר עשוי לפגום את הפונקציונליות של מנועים flagellar. חשוב להשתמש בתאי הרבה יותר משעה אחת בשקופית מיקרוסקופ שכן הם עלולים להפוך חמצן מדולדל. אופטימיזציה ניכרת ייתכן שיהיה צורך למצוא הדמיה את התנאים הטובים ביותר מי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את התרומות סוג של זני חיידקים מן הקבוצות של פרופ 'יהודית ארמיטג' (אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה), פרופ' קונרד Mullineaux (המלכה מרי באוניברסיטת לונדון, אנגליה). IMD ממומנת במשותף על ידי המחלקה לביוכימיה (אוניברסיטת אוקספורד) ו OCISB: AR ממומנת על ידי הנדסה המדעים הפיזיקליים המועצה למחקר (EPSRC) מלגת הלימודים DTC; ND ממומנת מן ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC); MCL הוא במימון מלגה החברה המלכותית מחקר באוניברסיטה.
Dobbie, I. M., Robson, A., Delalez, N., Leake, M. C. Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (31), e1508, doi:10.3791/1508 (2009).