العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة
Summary
الخلايا البطانية التي تشكل مستعمرة السلف (ECFCs) هي أداة واعدة لدراسة التوازن الأوعية الدموية والإصلاح.<sup> 1،2</sup> هذه الورقة بتقديم رواية الحيوان مصل طريقة مجانية للعزلة وتوسيع ECFC من الدم البشري heparinised الكبار الطرفية مع تجمع الصفيحات lysate الإنسان (pHPL) يقلل من مخاطر الألغام المضادة للالبقري التحصين.
Abstract
هذه الورقة بتقديم استراتيجية جديدة لإنعاش الخلايا البطانية السلف تشكيل مستعمرة (ECFCs) من heparinized لكن unmanipulated خلاف الكبار الدم المحيطي الإنسان داخل وسيلة من 12 يوما. ويمكن توسيع نطاق واسع بعد أن حصلت> 1×10 8 ECFCs لاجراء مزيد من الاختبارات. مفيد يمكن باستخدام pHPL استبعاد الاتصال بالخلايا البشرية مع مستضدات المصل البقري. ويمكن من خلال التدفق الخلوي والمناعية تتسم الخلايا المعزولة كما ECFC ويمكن اختبارها في المختبر لتشكيل وظائف الأوعية الدموية مثل الهياكل في مقايسة matrigel. ويمكن كذلك أن تكون هذه الخلايا حقن تحت الجلد في نموذج الفأر لتشكيل وظيفية ، perfused السفن في الجسم الحي. بعد التوسع والانتشار على المدى الطويل الحفظ بالتبريد والوظيفة والاستقرار الجيني يبدو أن الحفاظ عليها. 3،4
هذه العزلة من البروتين الحيواني الحر والأسلوب توسيع ينطبق بسهولة على توليد كمية كبيرة من ECFCs.
Protocol
Discussion
هذه العزلة رواية وطريقة توسيع عملية بسيطة وفعالة تكون أكثر كفاءة وأقل استهلاكا للوقت من خلال تجنب أي فصل الخلية (أي التدرج الكثافة المطلوبة) ، وأقل كلفة من التقنيات التقليدية. باستخدام اتصال pHPL لمستضدات الأبقار وxenoimmunization اللاحقة المفترضة هي مستبعدة. خلال الفترة من ا…
Acknowledgements
وأشكر الدكتور المؤلف كاتارينا Schallmoser لتوفير pHPL وFrühwirth مارغريتا وثالر دانييلا للحصول على مساعدة فنية ممتازة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Endothelial basal Medium-2 |
Lonza | 500ml | ||
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | ||
| preservative-free Heparin |
Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | ||
| L-Glutamine | Sigma | 2mM per EGM-2 | ||
| Penicillin and Streptomycin |
Sigma | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
||
| Trypsin/1mM EDTA | Gibco Cell Culture, Invitrogen |
7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
||
| PBS | ||||
| Four-layered cell factory (CF-4) |
Corning | |||
| Sterile Funnel | Corning | |||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | |||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) |
Becton Dickenson | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
||
| 50ml Falcon tubes | Falcon | |||
| 5ml Stripetts | Costar | |||
| 25ml Stripetts | Costar | |||
| Squeezer | Costar | |||
| 0,2 pore size sterile filter |
Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
