분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

Summary

Protocol

총 골수 준비

1. 네 B6 생쥐는 희생과 tibias, 대퇴골, 허리와 척추를 얻을 해부하고 있습니다.
2. 해부 동안 팔다리와 뼈는 PBS 2퍼센트 FCS 열 inactivated에 보관 (옵션 2mM EDA - 해부 매체를.)
3. 깨끗한 뼈가 해부 매체에 박격포와 유봉과 함께 깔린 있습니다. 그것을 할 효율적인 방법은 한 번에 다음 각 마우스의 tibias, 대퇴골과 엉덩이, 2 쪽이를 부술 것입니다.
4. 각 마우스에서 얻은 세포 혼합물은 별도의 보관 및 50ml 팔콘 튜브로 40μm 필터를 통해 필터링됩니다. 이런 방식으로, 각 튜브는 마우스, 2 쪽이에서 얻은 혼합물의 절반의 모든 다리 뼈 밖으로 얻은 세포 혼합되어 있습니다. 이 단계에서는 필터는 뼈 파편을 구분하는 데 사용됩니다.
5. 그것은 두 번 (NO 골수와) 뼛조각은 흰색을 얻기 위해 다리의 뼈를 부수기 위해서는 일반적으로 권장되고 척추 조각은 2 또는 3 번.
6. 그들이 균형을 이룰 수있는 튜브를 채워, 5 분 1200rpm을 스핀.
7. 뜨는을 기음과 튜브 랙 (이 단계는 클럼프 형성과 세포의 손실을 최소화하기 위해 각 원심 분리 후 중요합니다)에 튜브를 드래그하여 펠렛을 푸세요. 이 혈통 고갈을하고있다면 한 ML PBS 2퍼센트 FCS (지금부터 NO EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 각 튜브를 Resuspend,하거나 당신을 위해 편리하게 어떤 볼륨에 있습니다.

리니지 고갈

1. 이 절차는 매우 차별화된 세포를 제거하고 세포의 매우 이질적인 인구를 얻을, 줄기 및 전구 세포에 대한 풍부하게 할 수 있습니다. 당신은 HSC를 정렬하는 경우,이 단계는 크게 따라서 정렬 시간을 절감하고 귀하가 높은 숫자를 얻을 수 있도록 마우스의 높은 숫자 HSC를 정렬 있도록 셀 정렬을 통해 갈 필요 세포의 수를 감소 하나의 분류에 HSC.
2. 나중에 정렬하려고하는 경우 (흠없는 및 Sca1, C - 키트, CD48, Flk2 단일 색상 컨트롤) 컨트롤을 정렬을위한 세포 혼합물 (나는 보통 각 튜브의 조금을)를 50μl를 가져가라.
3. 린 칵테일 30ml/tube를 추가합니다. 리니지 칵테일은 불행히도 실험실에서 실험실에 조금 변화 항체 다양한 포함되어 있습니다. 스캐든 연구실에서 우리는 B220 Gr1에 대한 biotinilated 항체, Ter119, CD4, CD8, 인 경우에는 3 번 CD를 사용합니다. 얼룩 그들의 최종 희석은 1:700입니다.
4. 와동 신속하게 혼합, 4 15 분 부화 ° C.
5. 부화하는 동안 열 아래에있는 자석과 용출 15ml 튜브에 열을 준비. 데가스 일부 PBS는 steriflip 필터 (당신은 진공 흡인에 의한 PBS의 표면을 향해 이동 작은 공기 방울이 나타납니다)을 사용하고, 각각의 컬럼에 3ml degassed PBS를 적용하여 열 평형.
6. 열 흐름에 대한 1ml/5min이므로 사용할 준비가 열을 가지고 약 15 분 소요됩니다.
7. 부화의 끝에, 튜브를 작성하여 1200rpm에서 5 분 스핀 다운을 PBS 2% FCS를 추가합니다.
8. 뜨는을 기음, 알약을 풀어 1 ML / PBS를 degassed 튜브 resuspend.
9. 나중에 정렬하는 경우 (15ml, 각 튜브의 비트) 단일 색상 얼룩 CTRL 리니지 총 골수를 꺼내.
10. 신속 streptavidin 비즈 30ml/tube, 소용돌이 믹스, 4 15 분 부화 ° C. 추가
11. 부화의 끝에, 2 ML / degassed PBS의 튜브를 추가합니다. 열 아래에 새 컬렉션의 튜브를 넣어, 그리고 40μm 필터를 통해 필터링, 컬럼 각 서스펜션을 적용합니다.
12. 그것을 씻어 각 튜브에 degassed PBS의 다른 세 ML을 추가합니다. 컬럼이 비어되면 다시 같은 40μm 필터를 사용하여 적용됩니다.
13. eluate은 혈통이 소진 세포 혼합, 줄기와 progenitors 세포에 대한 풍부하게 이기종 인구가 포함되어 있습니다. 수영장이 튜브로 4 튜브의 내용. 1500rpm에서 5 분 스핀.
14. 뜨는을 대기음. 펠렛은 주로 흰색 또는 흰색해야합니다. 나중에 정렬하는 경우에는 산탄을 풀어 1ml 총 PBS 2% FCS에서 그들을 함께 resuspend 그렇지 않으면 당신을 위해 편리한 어떤 볼륨에 resuspend.

LKS 또는 장기 HSC 정렬

1. 고갈 단일 색상 얼룩 CTRL (15ml) 혈통 꺼내. 이것은 당신의 혈통 고갈의 효율성을 평가할 수 있습니다.
2. 정렬 셀 혼합물은 15ml 튜브에 물들어있다.

항체 추가 :

SCA PE - Cy5.5	1 : 100	10ml
키트 APC	1:100	10ml
SA PE - Cy7	1:500	2ml

장기 HSC를 정렬하려면, 또한 추가 :

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 PE	1:200	5ml

또한, 하나의 얼룩은 절개와 총 골수 가계 자국 후 별도로 보관 총 골수를 사용하여 컨트롤을 준비합니다. 이러한 stainings은 외과 튜브에 직접 할 수 있습니다.

어둠 속에서 수 있는지 확인하십시오!

1. 와동 빨리 ° 20~30분에 대한 C, 다시 혼합 반은 방법을 통해 4 믹스와 부화.
2. 항체의 초과 멀리 씻어, 1,500 rpm으로 5 분 PBS 2% FCS와 스​​핀으로 튜브를 입력합니다.
3. 뜨는 제거, 모든 알약을 resuspend 및 필터 모자 새로운 외과 튜브로 이동합니다. 그것은이 필터를 통과하기 위해 세포를 얻으려면 시간이 걸릴 수도 있습니다, 그리고 그것은 필터를 세척하고 세포의 손실을 최소화하기 위해 나중에 PBS 좀 더 적용하는 것이 중요합니다. 이 단계는 분류기의 막히는 것을 방지하는 것이 필요합니다, 이것은 모든 세포 분류기 사용자의 최악의 악몽이다.
4. 셀 정렬 시설에 세포를 나눠주고하면, 또한 전지를 수집합니다 PBS 10% HI FCS와 튜브를 준비했는지 확인하십시오.
5. 당신은 LKS 세포를 정렬하는 경우, 당신은 HSC와 multipotent progenitors을 repopulating 장기와 단기를 포함하는 이기종 인구를 얻을 것이다. 평균 수확량은 4 생쥐에서 300,000 LKS 있습니다.
6. 당신은 또한 CD48 항체와 Flk2을 사용한 적이있다면, 당신은 장기 HSC, 단기 HSC와 MPP의 각 인구를 분리할 수 있습니다. LT - HSC는 가장 드문 인구입니다. 평균 수확량은 4 생쥐에서 60,000에 50,000에 대한 세포입니다.