Summary

Het verkrijgen van Hemocytes van de Hawaiiaanse Bobtail Squid Euprymna scolopes En observatie van de Naleving van Symbiotische en niet-symbiotische bacteriën

Published: February 11, 2010
doi:

Summary

Deze video zal laten zien hoe je hemocytes (bloedcellen) te verkrijgen van de Hawaiiaanse Bobtail inktvis,<em> Euprymna scolopes</em> Voor gebruik in de celbiologische en bacteriële hechting testen. Hemocytes wordt gekleurd met een fluorescerende kleurstof en blootgesteld aan GFP-gemerkte bacteriën.

Abstract

Onderzoek naar de rol van het immuunsysteem in het bemiddelen moleculaire signalering tussen de heilzame bacteriën en hun gastheer hebben in de afgelopen jaren belangrijke bijdragen geleverd aan ons begrip van de co-evolutie van eukaryoten met hun microbiota. De symbiotische relatie tussen de Hawaiiaanse Bobtail inktvis,<em> Euprymna scolopes</em> En de lichtgevende bacterie<em> Vibrio fischeri</em> Is gebruikt als een modelsysteem voor het begrijpen van de effecten van gunstige bacteriën op dierlijke ontwikkeling. Recente studies hebben aangetoond dat macrofagen-achtige hemocytes, de enige cellulaire component van aangeboren de inktvis gastheer immuunsysteem van waarschijnlijker, een belangrijke rol spelen in het mediëren van de oprichting en het onderhoud van deze vereniging. Dit protocol zal demonstreren hoe hemocytes te verkrijgen van<em> E. scolopes</em> En vervolgens gebruik maken van deze cellen in bacteriële bindingstesten. Volwassen inktvis worden eerst verdoofd voordat hemolymfe wordt verzameld door spuit van de belangrijkste cefalische bloedvat. De gastheer hemocytes, vervat in de geëxtraheerde hemolymfe, in acht worden genomen chambered dekglaasjes en vervolgens blootgesteld aan green fluorescent protein-gelabeld symbiotische<em> Vibrio fischeri</em> En niet-symbiotische<em> Vibrio harveyi</em>. De hemocytes zijn tegengekleurd met een fluorescerende kleurstof (Cell Tracker Orange, Invitrogen) en vervolgens gevisualiseerd met behulp van fluorescentie microscopie.

Protocol

Bereid 500 ml van 0,22 um filter gesteriliseerde kunstmatig zeewater (FSW, zoutgehalte 35 ppt). Filter kunstmatige of natuurlijke zeewater door een 0,22 um micron filter om deeltjes en bacteriën te verwijderen. Verdoven een volwassen Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes) door plaatsing in een 2% oplossing van ethanol in FSW. Plaats het dier in narcose voor ongeveer 10 minuten. De inktvis zal ophouden te zwemmen en zal niet actief inspelen op te raken. Vervolg ademhaling, aangegeven door beweging van de mantel, …

Discussion

Onderzoek naar de rol van het immuunsysteem in het bemiddelen moleculaire signalering tussen de heilzame bacteriën en hun gastheer hebben in de afgelopen jaren belangrijke bijdragen geleverd aan ons begrip van de co-evolutie van eukaryoten met hun microbiota. Het squid / Vibrio-systeem heeft zich bewezen als een soepel model systeem om fundamentele vragen op dit gebied 2,3,5,6,8 te beantwoorden. Het licht-orgel van de inktvis Euprymna scolopes vergunningen kolonisatie uitsluitend door de lichtgevend…

Acknowledgements

Financieringsbronnen: University of Connecticut Research Foundation en het ministerie van Moleculaire en Cellulaire Biologie aan SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid-van onderzoek en Antonio H. en R. Majorie
Romano Graduate Education Fellowship voor AJC

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers)   Thermo-Fisher Scientific 155411  
26.5 G 1ml latex-free insulin syringe   Becton, Dickinson and Company C34551  
Cell Tracker Orange   Invitrogen C34551  
SteREO Discovery V20 Microscope   Zeiss    
SP2 Confocal Microscope   Leica    

References

  1. Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
  2. McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
  3. McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
  4. Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
  5. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
  6. Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
  7. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
  8. Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
check_url/fr/1714?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Collins, A. J., Nyholm, S. V. Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria. J. Vis. Exp. (36), e1714, doi:10.3791/1714 (2010).

View Video