在斑马鱼胚胎的单个神经元和神经嵴细胞的细胞运动和肌动蛋白细胞骨架的实时成像
Summary
本协议描述了生活的斑马鱼胚胎的单个神经元或神经嵴细胞成像。使用此方法来研究细胞行为和肌动蛋白定位使用荧光共焦时间推移显微镜。
Abstract
斑马鱼是一种理想的模型成像细胞在体内发育过程中的行为。斑马鱼的胚胎是外部受精，因而很容易在发展的各个阶段。此外，他们的光学清晰度，可在自然环境完整的胚胎细胞和分子动力学的高分辨率成像。我们使用的是一种实时成像方法，分析在神经嵴细胞迁移和神经轴突的生长和指导细胞的行为。
实时成像是了解调节细胞运动过程的机制，特别有用。要前伸活动和分子动力学，细胞运动的细节，如可视化，这是有利的标签单个细胞。在斑马鱼，质粒DNA注入产生一个短暂的马赛克的表达模式，并提供比其它细胞标记方法明显的好处。例如，转基因株系往往标签整个细胞群，从而有可能掩盖在一个单元格（或分子分布的变化）的罚款突起可视化。此外，在单细胞阶段的DNA注射，创伤小，更精确比染料注射在稍后阶段。
在这里，我们描述一个标签个别发展中国家的神经元或神经嵴细胞，其在体内的行为成像的方法。我们注入1 – 细胞期胚胎，结果马赛克转基因表达质粒DNA。载体含有细胞特异性启动子驱动的感觉神经元或神经嵴细胞的一个子集的兴趣的基因表达。我们提供膜有针对性的GFP标记的细胞或生物传感器探头，允许在活细胞1的F -肌动蛋白的可视化的例子。
埃里卡Namrata Asuri，安德森，和马修粘土贡献同样对这项工作。
Protocol
Discussion
注入的DNA的最佳浓度会有所不同规模和实力的推动者而兴建，并应凭经验确定。太多的DNA注射剂可能会导致不健康的胚胎具有广泛的细胞死亡，而太少会导致表达转基因注入胚胎的比例很小。 DNA的表达水平的荧光信号，从细胞到细胞的不同强度相关。在epifluorescence胚胎排序时，排除那些与表达非常高的水平。显得非常明亮的标记的细胞，通常也显示出明显的迹象，如细胞形态异常，标签分子misloc…
Acknowledgements
这项工作是支持由美国国立卫生研究院R01 NS042228妇幼保健奥林巴斯FV1000共聚焦与美国国立卫生研究院的共享仪器授予S10RR023717威斯康星大学动物学系（PI条例草案Bement）收购。
埃里卡Namrata Asuri，安德森，和马修粘土本文同等贡献。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
References
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