Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish
Summary
Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.
Abstract
Il pesce zebra è un modello ideale per i comportamenti delle cellule durante lo sviluppo di imaging in vivo. Embrioni di zebrafish sono fecondati esternamente e quindi facilmente accessibile in tutte le fasi di sviluppo. Inoltre, la loro chiarezza ottica permette l'imaging ad alta risoluzione del cellulare e dinamica molecolare in ambiente naturale dell'embrione intatto. Stiamo utilizzando un approccio dal vivo imaging per analizzare i comportamenti delle cellule durante la migrazione delle cellule neurali cresta e la conseguenza e la guida degli assoni neuronali.
Immagini dal vivo è particolarmente utile per comprendere i meccanismi che regolano i processi di motilità cellulare. Per visualizzare i dettagli della motilità cellulare, come l'attività protrusiva e dinamica molecolare, è vantaggioso per etichettare le singole celle. In zebrafish, iniezione di DNA plasmidico produce un transitorio pattern di espressione del mosaico e offre vantaggi distinti rispetto ad altri metodi di etichettatura delle cellule. Per esempio, linee transgeniche spesso etichetta popolazioni di cellule intere, e quindi possono oscurare la visualizzazione delle sporgenze fine (o cambiamenti nella distribuzione molecolare) in una singola cella. Inoltre, l'iniezione di DNA alla cellula uno stadio è meno invasiva e più precisa di iniezioni di colorante nelle fasi successive.
Qui si descrive un metodo per l'etichettatura di singoli neuroni di sviluppo o cellule della cresta neurale e di imaging il loro comportamento in vivo. Iniettiamo DNA plasmidico in 1 cellula-embrioni fase, che si traduce in espressione del transgene mosaico. I vettori contengono cellule specifiche per i promotori che l'espressione dell'unità di un gene di interesse in un sottogruppo di neuroni sensoriali o cellule della cresta neurale. Forniamo esempi di cellule marcate con GFP membrana mirati o con una sonda biosensore che consente la visualizzazione di F-actina in cellule viventi 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, e Matteo Argilla contribuito in maniera uguale a questo lavoro.
Protocol
Discussion
La concentrazione ottimale di DNA iniettato può variare a seconda delle dimensioni e la forza del promotore costruire e devono essere determinati empiricamente. L'iniezione di DNA troppo può portare a embrioni non sani con la morte delle cellule esteso, mentre troppo poco si tradurrà in una piccola percentuale di embrioni iniettati esprimere il transgene. Il livello di espressione del DNA è correlata con la potenza del segnale fluoroforo, che varia da cellula a cellula. Mentre l'ordinamento degli embrioni so…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 NS042228 di MCH I FV1000 Olympus confocale è stata acquisita con una strumentazione NIH condiviso S10RR023717 concedere al Dipartimento di Zoologia UW (PI Bement Bill).
Erica Andersen, Namrata Asuri, e Matteo Argilla contribuito in maniera uguale a questo articolo.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
References
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