Summary

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

Published: April 22, 2010
doi:

Summary

Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.

Abstract

O modelo de macaco rhesus é atualmente o melhor modelo disponível para o HIV-AIDS com respeito à compreensão da patogênese, bem como para o desenvolvimento de vacinas e terapêutica<sup> 1,2,3</sup>. Aqui, descrevemos um método para a análise detalhada fenotípica e funcional das respostas imunes celulares, especificamente a produção de citocinas intracelulares por células CD4 + e CD8 + T, bem como os subconjuntos de memória individual. Obtivemos precisas medidas quantitativas e qualitativas para a produção de interferon gama (INF-) e interleucina (IL) -2 em ambos os CD4 + e CD8 + T células do PBMC rhesus estimuladas com PMA mais ionomicina (PMA + I). Os perfis das citocinas foram diferentes nos diferentes subgrupos de células de memória. Além disso, este protocolo forneceu-nos a sensibilidade para demonstrar, mesmo frações menores de CD4 antígeno específico + e CD8 + subpopulações de células T dentro do PBMC amostras de macacos rhesus imunizadas com uma vacina contra o HIV cocktail envelope peptídeo desenvolvido em nosso laboratório. O multicolor técnica de citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa para identificar precisamente as diferentes populações de células T<sup> 4,5</sup> Com a produção de citocinas, capacidade<sup> 6</sup> Após a estimulação não-específica ou antígeno específico<sup> 5,7</sup>.

Protocol

Os procedimentos para a análise detalhada fenotípica e funcional do total, bem como subconjuntos de memória das células T pode ser dividido em quatro partes: 1) a preparação de células e estimulação antigênica, 2) coloração da superfície marcador, 3) coloração de citocinas intracelulares e 4) citometria de fluxo análises. 1. Preparação celular e estimulação antigênica Ambos os recém-isoladas, bem como crio-preservado células mononucleares do sangue periféri…

Acknowledgements

Dr. Pramod Nehete e Sra. Bharti Nehete de sangue e amostras de PBMC macaco; Este trabalho foi parcialmente financiado com recursos do NIH AI 46969 conceder, e todos os meios de cultura de células foram produzidos pelo Laboratório Central de Mídia, que é financiado pelo NIH conceder CA 16672.

Materials

Solution and Buffers

  • Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
  • Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
  • Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
  • BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)

Activation agents

  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
  • Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein

Cytokine secretion inhibitors

  • Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)

Antibodies

  • Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
  • CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)

References

  1. Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
  2. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
  3. Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
  4. Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
  5. Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
  6. Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
  7. Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
  8. Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
  9. Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
  10. De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
  11. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).

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Citer Cet Article
He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. (38), e1743, doi:10.3791/1743 (2010).

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