Nous démontrons l'utilité de la cytométrie en flux multicouleur pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle détaillée du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes CD4 + et CD8 + T dans les macaques rhésus, le modèle idéal pour les études de vaccin contre le VIH / SIDA.
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Article de méthode
Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le modèle macaque rhésus est actuellement le meilleur modèle disponible pour le VIH-sida à l'égard de la compréhension de la pathogenèse, ainsi que pour le développement de vaccins et de thérapeutiques
Protocole
Les procédures pour les analyses détaillées phénotypiques et fonctionnels du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes T peut être divisé en quatre parties: 1) la préparation des cellules et la stimulation antigénique, 2) coloration marqueur de surface, 3) coloration des cytokines intracellulaires et 4) La cytométrie en flux analyses.
1. Préparation des cellules et la stimulation antigénique
- Les deux fraîchement isolées ainsi que la cryo-préservé les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été utilisés dans ce protocole. Les PBMC ont été isolées à partir hépariné ou citraté échantillons de sang....
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Remerciements
Dr Pramod Nehete et Mme Bharti Nehete pour le sang et les échantillons de PBMC de macaques; Ce travail a été partiellement financé par des fonds de NIH IA 46969, et tous les milieux de culture cellulaire ont été produites par le Laboratoire central des médias, qui est financé par le NIH octroi CA 16672.
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Matériaux
Solution et tampons
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 (HyClone laboratoires, Logan, UT)
- Sérum de veau fœtal (FBS), (HyClone laboratoires, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Pénicilline / streptomycine (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Le bleu trypan réactif (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Tris 50 mM, pH 8,6; filtrée et stocker à 4 ° C
- PBS Dulbecco (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life Technologies, Rockville, MD)
- Tampon de lavage de débit: supplément DPBS avec 2% de FBS, conserver à 4 ° C
- BD Cytofix / Cytoperm fixation / perméabilisation Solution Kit (BD Biosciences, San Jose, CA)
Agents d'activation
- Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulation mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA)
- L'affinité des anticorps purifiés F (ab) 2 fragments de chèvre anti-souris IgG (H + L) (Kierkegaard et Perry laboratoire, Gaithersburg, MD)
- Agents d'activation spécifiques pourraient inclure des piscines peptide, le peptide seul ou protéine entière
Inhibiteurs de la sécrétion des cytokines
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Branchez Golgi peuvent être utilisées alternativement (BD Biosciences, San Jose, CA)
Anticorps
- Live / Dead fixable Aqua Kit colorant fluorescent (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- CD4 Pacific Blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- CD28-PerCP Cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17h12), (BD Biosciences, San Jose, CA)
Références
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Viru....
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Réimpressions et autorisations
