出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析
Summary
遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する<em>サッカロマイセスセレビシエ</em>。
Abstract
遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する<em>サッカロマイセスセレビシエ</em>。このプロトコルは、タンパク質の過剰発現に基づいていますが、それは容易にタンパク質発現の抑制に依存する形態学的表現型に適合させることができる。私たちの研究室では、エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のepsinのシグナル伝達特性の研究に興味を持っています。その目的のために我々が保存を過剰発現しているドミナントネガティブアプローチを使用<u> E</u> psin<u> N</u> -<u> T</u> erminal<u> H</u内因性epsin – 2（Ent2またはYLR206W）の機能と干渉するために> omology（ENTH）ドメイン。我々は、足場タンパク質、septinsの家族のmislocalizationに依存している細胞分裂の欠陥につながった野生型細胞でEnt2（ENTH2）のENTHドメインの過剰発現を観察した。
Protocol
Discussion
このプロトコルは、タンパク質の過剰発現時に形態学的表現型（適切な細胞分裂を受けることができない酵母細胞）の開発を監視する方法について説明します。この手順を行うときは、それより速いスピードで細胞や不明瞭な結果を傷める可能性がありますので、推奨遠心速度で沈殿させ、酵母細胞を採取することを忘れないことが重要です。メチレンブルーとCalcofluor白は、それらが有毒で…
Acknowledgements
我々は有用な議論とサポートのためにブライアンG.クーンとクラウディアB.ハンナに感謝。このプロジェクトは出発から立ち上げ資金によってサポートされていました。生物科学、R.クラウディオアギラとパーデュー大学がんセンター経由R.クラウディオアギラに米国癌学会機関の研究助成にパデュー大学。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
References
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