Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Summary

Procedimento para fertilizar<em> Oócitos Xenopus</em> Pelo método de transferência de host.

Abstract

Estudar a contribuição de moléculas herdada da mãe para o desenvolvimento inicial dos vertebrados é frequentemente prejudicada pelo tempo e despesa necessária para gerar animais mutantes efeito materno. Além disso, muitas das técnicas para superexpressão ou inibir a função do gene em organismos como Xenopus e zebrafish não suficientemente alvo crítico materna vias de sinalização, tais como sinalização Wnt. Em Xenopus, manipulando a função do gene em oócitos cultivados e, posteriormente, fecundá-los pode amenizar esses problemas até certo ponto. Ovócitos são manualmente defolliculated de tecido de ovário doador, injetado ou tratados de cultura como desejado, e então estimulados com progesterona para induzir a maturação. Em seguida, os oócitos são introduzidos na cavidade do corpo de um sapo anfitrião ovulando feminino, quando então eles serão translocados através do oviduto do hospedeiro e adquirir modificações e casacos de geléia necessário para a fertilização. Os embriões resultantes podem então ser aumentado para o estágio desejado e analisadas para os efeitos de quaisquer perturbações experimental. Este método de transferência de anfitrião tem sido altamente eficaz em descobrir mecanismos básicos do desenvolvimento inicial e permite uma ampla gama de possibilidades experimentais não disponíveis em qualquer outro organismo vertebrado modelo.

Protocol

1. Remoção cirúrgica do tecido do ovário Prepare um novo lote de meio de cultura de oócitos (OCM; Materials), entre 400-800 mL, dependendo do tamanho do experimento. Ajustar o pH a 7,6-7,8, até que o vermelho de fenol tem uma cor vermelho escuro (seis ou mais pequenas gotas de 5N NaOH). Derramar uma pequena quantidade para verificar o pH em um tubo separado desde o eletrodo de pH pode contaminar os meios de comunicação. OCM deve ser armazenado a 18 ° C e utilizada dentro de uma semana….

Discussion

A transferência bem sucedida irá resultar na fertilização e clivagem normal de> 50% dos oócitos (Figura 3). Geralmente entre 30-60% dos oócitos transferidos sobreviverá após os estágios nêurula. Nós normalmente transferência 75-150 oócitos por grupo experimental, que vai produzir embriões suficientes para vários tipos de análise (in situ, RT-PCR), bem como visualizar o fenótipo. Implantação de ovócitos substancialmente mais não parece aumentar significativamente o rendimento. Além disso, pelo me…

Materials

Solutions and recipes:

OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)

70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine)	(Invitrogen 11415-064)
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V)	(Sigma A-9418-50g)
1x Penicillin-Streptomycin	(Sigma P-0781)
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH
Make fresh weekly, store at 18°C.

10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)

1M NaCl

20 mM KCl

20 mM CaCl2

10 mM MgCl2

150 mM HEPES

adjust to pH 7.6-7.8

Store at 4°C

Anesthetic solution

1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222)	(Sigma A-5040)
0.7 g/L sodium bicarbonate
Dissolve in Amquel-treated water
Make fresh weekly

Progesterone stocks

10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol

Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution

Store at -20°C

Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)

Blue: 0.1% Nile Blue A	(Aldrich 121479-5G),
Red: 0.25% Neutral Red	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Green (80 μl blue + 80 μl brown),
Mauve (80 μl blue + 80 μl red).
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown.

Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.