Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres
Summary
Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l'utilisation de cette technologie pour l'étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.
Abstract
Photoactivation de composés cibles dans un organisme vivant a prouvé une approche intéressante pour étudier divers processus biologiques tels que le développement embryonnaire, la signalisation cellulaire et la physiologie adulte. À cet égard, l'utilisation de multi-microscopie biphotonique permet photoactivation quantitative d'un agent donné réactive la lumière dans les tissus profonds, à une résolution seule cellule. Comme embryons de poissons zèbres sont optiquement transparents, leur développement peut être contrôlé in vivo. Ces traits font le poisson zèbre, un organisme modèle parfait pour contrôler l'activité d'une variété d'agents chimiques et des protéines par la lumière concentrée. Nous décrivons ici l'utilisation de la microscopie à deux photons pour induire l'activation de la cage chimiquement la fluorescéine, qui à son tour nous permet de suivre le destin des cellules dans des embryons de poisson zèbre en direct. Nous utilisons des embryons exprimant un point de repère direct génétique (GFP) pour localiser et cibler précisément les cellules d'intérêt. Cette procédure peut être également utilisé pour l'activation induite précise la lumière des protéines, des hormones, des petites molécules et autres composés en cage.
Protocol
Discussion
Photo-activable composés sont des molécules dont la fonction est masqué jusqu'à ce qu'ils soient éclairés par une longueur d'onde spécifique (généralement UV), induisant une réaction photochimique qui convertit les molécules dans un état biologiquement ou chimiquement active. Ces sondes fournissent des outils très puissants dans la recherche en biologie cellulaire, puisque l'activation peut être contrôlée avec précision temporellement et spatialement en limitant leur exposition à la lum…
Acknowledgements
Merci sont dus à Génia Brodsky pour la figure graphiques; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, et Leonid Roitman pour des conseils et une assistance technique avec le uncaging deux photons; Maayan Tahor et Suliman Elsadin d'assistance technique; Uwe Strähle d'avoir bien voulu fournir la ligne de journaliste et de neurogenin1 Amos Gutnick pour les commentaires sur ce manuscrit. La recherche dans le laboratoire Levkowitz est soutenu par la Fondation allemande-israélien (le numéro de subvention 183/2007); Israel Science Foundation (numéro de subvention 928/08) et le Harriet & Marcel Dekker Fondation. GL est un titulaire de la Chaire Développement Tauro carrière en recherche biomédicale.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
