Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo's
Summary
Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo's. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.
Abstract
Fotoactivatie van target verbindingen in een levend organisme heeft bewezen een waardevolle benadering van de verschillende biologische processen, zoals de embryonale ontwikkeling, cellulaire signalering en volwassen fysiologie te onderzoeken. In dit opzicht is het gebruik van multi-foton microscopie mogelijk kwantitatieve fotoactivering van een bepaalde licht reagerende agent in diepe weefsels op een enkele cel resolutie. Omdat zebravis embryo's worden optisch transparant, kan hun ontwikkeling worden gevolgd in vivo. Deze eigenschappen maken de zebravis een perfecte modelorganisme voor het regelen van de activiteit van een groot aantal chemische stoffen en de eiwitten door gericht licht. Hier beschrijven we het gebruik van twee-foton microscopie om de activering van chemisch gekooide fluoresceïne, die op zijn beurt laat ons toe om het lot van cellen te volgen in live zebravis embryo's induceren. We maken gebruik van embryo's uiten van een live-genetische mijlpaal (GFP), te lokaliseren en precies te richten alle cellen van belang. Deze procedure kan eveneens worden gebruikt voor exacte licht geïnduceerde activatie van eiwitten, hormonen, kleine moleculen en andere gekooide verbindingen.
Protocol
Discussion
Foto-activeerbare verbindingen zijn moleculen waarvan de functie wordt gemaskeerd totdat ze worden verlicht met een specifieke golflengte (meestal UV), het induceren van een fotochemische reactie die de moleculen omgezet in een biologisch of chemisch actieve toestand. Deze probes geven een zeer krachtige tools in de celbiologie onderzoek, omdat de activering kan nauwkeurig worden tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerd door beperking van hun blootstelling aan licht.
Het grote voordeel van mult…
Acknowledgements
Dank gaat uit naar Genia Brodsky voor figuur graphics, Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, en Leonid Roitman voor technisch advies en assistentie met de twee-foton uncaging, Maayan Tahor en Suliman Elsadin voor technische bijstand; Uwe Strahle zo vriendelijk het verstrekken van de neurogenin1 verslaggever lijn en Amos Gutnick voor reacties op dit manuscript. Het onderzoek in de Levkowitz lab is ondersteund door de Duits-Israëlische Foundation (subsidie nummer 183/2007); Israel Science Foundation (subsidie nummer 928/08) en de Harriet & Marcel Dekker Foundation. GL is een taak van de Tauro Career Development Chair in biomedisch onderzoek.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
