שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות
Summary
מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.
Abstract
Photoactivation של תרכובות מטרה בכל יצור חי הוכיחה גישה ערך לחקור תהליכים ביולוגיים שונים, כגון ההתפתחות העוברית, איתות הסלולר ופיזיולוגיה מבוגר. מבחינה זו, השימוש במיקרוסקופ רב פוטון מאפשרת photoactivation כמותי של סוכן ניתנה תגובה אור רקמות עמוק ברזולוציה של תא בודד. כמו עוברי דג הזברה הם שקוף אופטית, הפיתוח שלהם יכול להיות פיקוח in vivo. תכונות אלה הופכות את דג הזברה אורגניזם מודל מושלם לבקרת פעילות של מגוון רחב של חומרים כימיים חלבונים על ידי אור ממוקד. כאן אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים לגרום הפעלת והעמסת בכלוב כימית, אשר בתורו מאפשר לנו לעקוב אחר גורלו של תא חי עוברי דג הזברה. אנו משתמשים העוברים להביע ציון דרך גנטי חיים (GFP) לאתר למקד את כל התאים של עניין. הליך זה יכול לשמש באותה מידה להפעלת מדויק המושרה אור של חלבונים, הורמונים, מולקולות קטנות ותרכובות אחרות בכלוב.
Protocol
Discussion
Photo-activatable תרכובות הם מולקולות שתפקידו רעולי פנים עד שהם מוארים עם אורך גל מסוים (UV בדרך כלל), גרימת תגובה פוטו הממירה את מולקולות למצב פעיל מבחינה ביולוגית או כימית. בדיקות אלה מספקים כלים חזקים מאוד בתחום המחקר בביולוגיה של התא, מאז ההפעלה ניתן לשלוט בדיוק temporally מרחב?…
Acknowledgements
תודה הן בשל ג'ניה ברודסקי עבור דמות גרפיקה, ויאצ'סלב Kalchenko, דאגלס לוץ, וליאוניד רויטמן ייעוץ סיוע טכני עם משחררות רפרוף שני הפוטונים, מעיין טהור לבין סולימאן Elsadin לקבלת סיוע טכני; Uwe Strahle עבור באדיבות מתן קו כתב neurogenin1 ו עמוס גוטניק הערות על כתב היד הזה. המחקר במעבדה לבקוביץ נתמך על ידי הקרן הגרמנית ישראלית (מספר המענק 183/2007); הקרן הלאומית למדע (מענק מספר 928/08) ואת הארייט & מרסל דקר קרן. GL הוא מופקד הקתדרה פיתוח קריירה Tauro במחקר ביו.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
