ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化
Summary
多光子顕微鏡は深く、光浸透と低光毒性を持つ低エネルギーの光子の制御が可能になります。我々は、ゼブラフィッシュ胚における生細胞標識のためのこの技術の使用について説明します。このプロトコルは、容易に様々な光反応性分子の光誘導に適合させることができる。
Abstract
生体内のターゲット化合物の光活性化は、胚発生、細胞内シグナル伝達と成人の生理学など様々な生物学的プロセスを調査するために貴重なアプローチを証明しています。この点では、多光子顕微鏡の使用は、単一のセルの解像度で深部組織に与えられた光反応剤の定量的な光活性化が可能になります。ゼブラフィッシュの胚は、光学的に透明であるため、その開発は、 生体内で監視することができます。これらの特性は、ゼブラフィッシュ集束光による化学物質やタンパク質の様々な活動を制御するための完璧なモデル生物にします。ここでは、順番に私たちが生きてゼブラフィッシュの胚では細胞の運命に従うことができるように化学的にケージフルオレセイン、の活性化を誘導するために二光子顕微鏡の使用を説明します。我々は、関心の任意のセルを検索し、正確にターゲットとするライブ遺伝的ランドマーク（GFP）を発現する胚を使用してください。この手順は、同様にタンパク質、ホルモン、低分子化合物と他のケージド化合物の正確な光誘導活性化のために使用することができます。
Protocol
Discussion
写真-活性化可能化合物は、その機能は、それらが特定の波長（通常UV）を照射されるまで、生物学的または化学的に活性な状態に分子を変換する光化学反応を誘起する、マスクされている分子である。アクティベーションが正確に光への露出を制限することにより、時間的空間的に制御できるので、これらのプローブは、細胞生物学の研究で非常に強力なツールを提供しています。
<p…Acknowledgements
親切にneurogenin1レポーターのラインを提供するためのウーヴェStrahleと、ヴャチェスラフKalchenko、ダグラスルッツ、そして二光子アンケージングによる技術的な助言と支援のためのレオニードRoitman; Maayan Tahorと技術支援のためのSuliman Elsadinおかげで図グラフィックスのためのGENIAブロツキーによるものであるこの原稿でのコメントのアモスGutnick。イスラエル科学財団（助成番号928/08）とハリエット＆マルセルデッカー財団、Levkowitzラボでの研究は、ドイツとイスラエル財団（助成番号2007分の183）によってサポートされています。 GLは、生物医学研究におけるタウロのキャリア開発委員長の責務であると信ずる。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
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