De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra
Summary
Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.
Abstract
La fotoactivación de compuestos de interés en un organismo vivo ha demostrado ser un enfoque valioso para investigar diversos procesos biológicos como el desarrollo embrionario, la señalización celular y la fisiología del adulto. En este sentido, el uso de multi-fotón microscopio permite fotoactivación cuantitativa de un determinado agente de la luz sólo responde en los tejidos profundos en una resolución única célula. Como embriones de pez cebra son ópticamente transparente, su desarrollo puede ser monitoreado en vivo. Estas características hacen que el pez cebra un organismo modelo ideal para el control de la actividad de una variedad de agentes químicos y proteínas de la luz enfocada. A continuación se describe el uso de la microscopía de dos fotones para inducir la activación de la jaula químicamente con fluoresceína, que a su vez nos permite seguir el destino de células en embriones de pez cebra en vivo. Nosotros usamos embriones expresar un punto de referencia en vivo genética (GFP) para localizar y orientar con precisión la presencia de células de interés. Este procedimiento también se puede utilizar para la activación inducida por la luz precisa de proteínas, hormonas, moléculas pequeñas y otros compuestos enjaulados.
Protocol
Discussion
Foto activable compuestos son moléculas cuya función es enmascarados hasta que se ilumina con una longitud de onda específica (generalmente UV), que induce una reacción fotoquímica que convierte las moléculas en un estado biológicamente o químicamente activos. Estas sondas proporcionan herramientas muy poderosas en la investigación de biología celular, ya que la activación puede ser controlada con precisión temporal y espacialmente, al limitar su exposición a la luz.
La ventaja …
Acknowledgements
Se agradece a Genia Brodsky de la figura de gráficos, Vyacheslav Kalchenko, Lutz Douglas, y Leonid Roitman de asesoramiento y asistencia técnica con el uncaging de dos fotones, Maayan Tahor y Suliman Elsadin de asistencia técnica; Uwe Strähle por la amabilidad de ofrecer la línea de reportero y neurogenin1 Amos Gutnick a los comentarios de este manuscrito. La investigación en el laboratorio Levkowitz con el apoyo de la Fundación alemana-israelí (el número de concesión 183/2007), Israel Science Foundation (subvención número 928/08) y la Harriet y Marcel Dekker Fundación. GL es un titular de la Cátedra de Desarrollo Tauro carrera en la investigación biomédica.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
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