Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon
Summary
Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.
Abstract
Yaşayan bir organizma hedef bileşiklerin fotoaktivasyon gibi, embriyonik gelişim, hücresel sinyal ve yetişkin fizyoloji gibi çeşitli biyolojik süreçleri araştırmak için değerli bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Bu bağlamda, multi-foton mikroskopi kullanımı, tek bir hücrenin çözünürlükte derin dokularda belirli bir ışık duyarlı ajan kantitatif fotoaktivasyon sağlar. Zebra balığı embriyolar optik şeffaf olduğu için, onların gelişimi in vivo olarak izlenebilir. Bu özellikler zebrafish odaklı ışığı ile kimyasal ajanlar ve proteinlerin çeşitli aktivite kontrol etmek için mükemmel bir model organizma. Burada biz, bizi, canlı zebrafish embriyolarının hücrenin kaderini takip kimyasal kafesli floresein aktivasyonu ikna etmek için iki-foton mikroskopi kullanımını tanımlamak. Biz, herhangi bir ilgi hücreleri bulmak ve hassas hedef canlı genetik bir dönüm noktası (GFP) ifade embriyolar kullanın. Bu prosedür, aynı şekilde, proteinleri, hormonlar, küçük moleküller ve diğer kafesli bileşikler hassas ışık kaynaklı aktivasyonu için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Foto-aktive bileşikler fonksiyonu moleküllerin biyolojik ya da kimyasal olarak aktif bir devlet haline dönüştüren bir fotokimyasal reaksiyon inducing (genellikle UV), belirli bir dalga boyu ile aydınlatılmış kadar maskeli moleküllerdir. Aktivasyon ışığa maruz kaldıkları sınırlayarak tam zamansal ve mekansal olarak kontrol edilebilir beri bu probları, hücre biyolojisi araştırmalarında çok güçlü araçlar sunuyoruz.
Çok foton mikroskopi önemli bir avantaj, nispeten…
Acknowledgements
Uwe Strahle ve nazik neurogenin1 muhabir hattı sağlamak için; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz ve teknik danışmanlık ve yardım için iki foton uncaging ile Leonid Roitman;; Maayan Tahor ve teknik yardım için Suliman Elsadin sayesinde şekil grafik genia Brodsky nedeniyle Bu yazının yorumları için Amos Gutnick. İsrail Bilim Vakfı (hibe sayısı 928/08) ve Harriet & Marcel Dekker Vakfı; Levkowitz laboratuarında araştırma Alman-İsrail Vakfı (hibe sayısı 183/2007) tarafından desteklenmektedir. GL Biyomedikal Araştırma Tauro Kariyer Geliştirme Başkanı bir görevdeki.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
