Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin

Summary

Tinción inmunohistoquímica suspensión de las células madre pluripotentes (hPSCs) para los marcadores de la superficie celular (SSEA-3/SSEA-4) se logró basada en el uso de un aparato hecho a sí mismo citospina para crear una monocapa de células para la observación y cuantificación.

Abstract

Las células madre pluripotentes (hPSCs) que incluyen células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) son una fuente interesante de células debido a su ilimitada capacidad de auto-renovación y su potencial de diferenciarse en múltiples tipos de células. El estado pluripotente de hPSCs se suele evaluar mediante técnicas como la PCR cuantitativa, inmunocitoquímica, y por otros<em> In vitro</em> Y<em> In vivo</em> Estrategias de diferenciación en múltiples tipos de células. Entre ellas, las técnicas de inmunohistoquímica se han desarrollado para la caracterización de rutina del estado indiferenciado de hPSCs basado en el análisis de biomarcadores candidatos intracelular y la superficie celular. Teniendo en cuenta el hecho de que hPSCs crecen como colonias, los problemas surgen en la cuantificación de la expresión de estos marcadores en el nivel de células individuales en forma rutinaria. Análisis de citometría de flujo sirven para solucionar este problema, pero requieren el número de células y el uso de reactivos que normalmente no son propicias para la evaluación de rutina de control de calidad de las culturas hPSC. Por lo tanto, el desarrollo de medios prácticos y reproducible de la creación de muestras monocapa de células con integridad conservado para la evaluación de marcadores tiene muchas ventajas en la investigación con células madre. Esto beneficia en gran medida el análisis inmunocitoquímico, porque las células individuales de la monocapa pueden ser fácilmente observados y cuantificados para la expresión de marcadores específicos. Para lograr este objetivo, un aparato hecho a sí mismo citospina fue construido y optimizado para su uso con la tinción inmunohistoquímica. Dos marcadores de la superficie celular (SSEA3/SSEA4) la expresión se analizaron en una línea de células madre variante BG01 con el propósito de este protocolo.

Protocol

Parte 1: La tinción inmunocitoquímica de suspensión Las células se recogen en una suspensión de células individuales. Las células se transfieren a tubos de microcentrífuga de 1,5 2 ml y se centrifuga a 200 g durante 4 minutos. Se lavan las células mediante la aspiración de sobrenadante, se resuspendieron en 1 ml de PBS – (sin Mg 2 + y Ca 2 +) y luego se centrifuga de nuevo a 200 g durante 4 minutos. Esto debe hacerse dos veces. Después del lavado,…

Discussion

A los efectos de nuestro laboratorio, un plato de 35 mm de cultivos de células madre cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEFs) es asignado para el procedimiento de tinción inmunohistoquímica para su uso con el aparato cytospin. Las células se recogen por medio de pases enzimática, eliminar la mayor cantidad de la capa de MEF como sea posible, en una suspensión de una sola célula. Si más eficaz de aislamiento de células madre de la capa de MEF se desea, las colonias pueden ser recogidos manualmente…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Lab Tek Permanox Chamber Slide		Thermo Fisher Scientific	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips		USA Scientific	1121-3810
Microscope Cover Glass		Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280		Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS		Gibco	14190
Normal Goat Serum		Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride		CalBioChem	268298