Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Summary

Suspension immunzytochemische Färbung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Zell-Oberflächen-Marker (SSEA-3/SSEA-4) wurde basierend auf der Verwendung einer self-made Zytospin Apparat zu einer Monoschicht von Zellen für die Beobachtung und Quantifizierung erstellen erreicht.

Abstract

Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), dass menschliche embryonale Stammzellen (hES) und der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) enthalten, werden spannende Zellquellen aufgrund ihrer grenzenlosen Selbst-Erneuerung Fähigkeiten und ihr Potenzial, in verschiedenen Zelltypen zu differenzieren. Die pluripotenten Zustand hPSCs ist in der Regel durch Techniken wie qPCR, Immunzytochemie beurteilt und von anderen<em> In-vitro-</em> Und<em> In vivo</em> Differenzierung Strategien in verschiedenen Zelltypen. Unter diesen haben immunzytochemische Techniken zur Routine Charakterisierung der undifferenzierten Zustand der hPSCs auf der Analyse der Kandidat intra-und Zell-Oberflächen-Biomarkern entwickelt worden. Angesichts der Tatsache, dass hPSCs als Kolonien, Probleme bei der Quantifizierung der Expression dieser Marker an den einzelnen Zell-Ebene auf einer routinemäßigen entstehen wachsen. Durchflusszytometrie-Analysen dienen dazu, dieses Problem zu lösen, sondern bedürfen Zellzahlen und die Verwendung von Reagenzien, die normalerweise nicht förderlich für die routinemäßige Qualitätskontrolle Beurteilung HPSC Kulturen. So hat die Entwicklung von praktischen und reproduzierbare Mittel zur Schaffung von Monolayer Zellproben mit erhaltener Integrität für Marker Auswertung viele Vorteile in der Stammzellforschung. Diese großen Nutzen immunzytochemische Analyse, weil einzelne Zellen aus dem Monolayer leicht beobachtet werden können und quantifiziert für die Expression spezifischer Marker. Mit diesem Ziel wurde ein self-made Zytospin Apparat konstruiert und optimiert für den Einsatz mit immunzytochemische Färbung. Zwei Zelloberflächen-Marker (SSEA3/SSEA4) Expression wurden in einer Variante BG01 Stammzell-Linie für die Zwecke dieses Protokolls analysiert.

Protocol

Teil 1: Die Aussetzung immunzytochemische Färbung Die Zellen werden in einer einzigen Zellsuspension geerntet. Die Zellen werden dann in 1,5-2ml Reaktionsgefäße überführt und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten. Die Zellen werden durch Absaugen aus Überstand gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert – (ohne Mg 2 + und Ca 2 +) und dann wieder bei 200g für 4 Minuten zentrifugiert. Dies sollte zweimal durchgeführt werden. Nach dem Waschen werden die Zellen…

Discussion

Für die Zwecke unseres Labors, ist ein 35-mm-Schale von Stammzell-Kulturen auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) gewachsen für die immunzytochemische Färbung Verfahren für den Einsatz mit dem Zytospin Apparat zugeteilt. Die Zellen werden dann mit Hilfe von enzymatischen Passagieren gesammelt, die Beseitigung so viel von der MEF-Schicht wie möglich, in einen Ein-Zell-Suspension. Wenn effektiver Stammzellen isoliert von der MEF-Schicht gewünscht wird, kann Kolonien manuell kommissioniert dann verdaut in Suspensio…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Lab Tek Permanox Chamber Slide		Thermo Fisher Scientific	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips		USA Scientific	1121-3810
Microscope Cover Glass		Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280		Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS		Gibco	14190
Normal Goat Serum		Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride		CalBioChem	268298