ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin
Summary
מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.
Abstract
אדם בתאי גזע pluripotent (hPSCs) הכוללים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) האדם הנגרמת גזע pluripotent תאים (hiPSCs) הם מקורות תא מרגש עקב התחדשות עצמית שלהם יכולות בלתי מוגבלות הפוטנציאל שלהם להתמיין לסוגי תאים שונים. המדינה pluripotent של hPSCs נבחנת בדרך כלל על ידי טכניקות כגון qPCR, immunocytochemistry, ועל ידי אחרים<em> במבחנה</em> ו<em> In vivo</em> בידול אסטרטגיות לתוך תאים מסוגים שונים. בין אלה, טכניקות immunocytochemical פותחו לאפיון שגרתית של המדינה מובחן של hPSCs מבוסס על ניתוח של סמנים ביולוגיים המועמד תאיים על פני קרום התא. בהתחשב בעובדה hPSCs לגדול מושבות, בעיות המתעוררות לכימות ביטוי של סמנים אלה ברמת התא היחיד על בסיס שגרתי. Cytometry ניתוח תזרים לשמש כדי לטפל בבעיה זו אך דורשים מספרים סלולריים השימוש ריאגנטים כי הם לא תורם בדרך כלל הערכה מלאה שגרתית איכות של תרבויות hPSC. לפיכך, פיתוח של אמצעים מעשיים לשעתקו של יצירת תאים בדגימות monolayer עם יושרה נשמרים לצורך הערכה סמן יש יתרונות רבים במחקר בתאי גזע. זה מאוד יתרונות ניתוח immunocytochemical כי תאים בודדים מתוך monolayer ניתן להבחין בקלות לכמת ביטוי של סמנים ספציפיים. לקראת מטרה זו, מנגנון מתוצרת עצמית cytospin נבנה מותאם לשימוש עם מכתים immunocytochemical. שני סמנים על פני קרום התא (SSEA3/SSEA4) ביטוי נותחו קו גרסה BG01 תא גזע לצורך פרוטוקול זה.
Protocol
Discussion
לענין במעבדה שלנו, צלחת 35mm של תא גזע תרבויות גדל על fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הוא המוקצב ההליך מכתים immunocytochemical לשימוש עם מנגנון cytospin. התאים נאספים אז באמצעות האנזימטית passaging, הסרת כמה שכבת MEF ככל האפשר, תוך השעיית תא בודד. אם גזע יותר יעיל תא הבידוד מהשכבה MEF הוא הרצוי, מו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון חלקי עבור עבודה זו סופק על ידי קריירה NSF 0744556 (Rao) וכן מלגה דרך VCU-HHMI המדע החינוך תוכנית המחקר (פסקואל).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 117437 | Material for re-used plastic slides | |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific | 1121-3810 | ||
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | ||
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium | |
| DPBS | Gibco | 14190 | ||
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | ||
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining | |
| DAPI, Dihydrochloride | CalBioChem | 268298 |
References
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. – Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
