Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios
Summary
Este artículo muestra cómo utilizar correctamente el BioRad Helios pistola de genes para introducir ADN plásmido en las células epidérmicas de cebolla y la forma de prueba para las interacciones proteína-proteína en las células de la cebolla basa en el principio de fluorescencia de Complementación bimolecular (BiFC)
Abstract
Investigación de la función de genes en diversos organismos se basa en el conocimiento de cómo los productos de los genes interactúan unos con otros en su ambiente celular normal. La complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) Ensayo<sup> 1</sup> Permite a los investigadores visualizar interacciones proteína-proteína en las células vivas y se ha convertido en una herramienta de investigación fundamental. Este ensayo se basa en la asociación facilitado de dos fragmentos de una proteína fluorescente (GFP), que son cada uno unido a un socio potencial de interacción proteína. La interacción de los dos socios de la proteína que facilitaría la asociación de la N-terminal y C-terminal del fragmento de la GFP, lo que lleva a la fluorescencia. Para los investigadores de plantas, células epidérmicas de cebolla son un sistema ideal de experimentación para la realización de la prueba BiFC debido a la facilidad en la obtención de tejidos y la preparación de la cebolla y la visualización directa de la fluorescencia con un mínimo de fluorescencia de fondo. La pistola de genes Helios (BioRad) se utiliza comúnmente para bombardear plásmido de ADN en células de cebolla. Se demuestra el uso de Helios pistola de genes para introducir construcciones de plásmidos durante dos interactuando<em> Arabidopsis thaliana</em> Factores de transcripción, Seuss (SEU) y homólogo Leunig (LUH)<sup> 2</sup> Y la visualización de sus interacciones mediadas por las células de cebolla BiFC en la epidermis.
Protocol
Discussion
- Para los usuarios de primera vez, se recomienda la práctica de todo el procedimiento, desde la preparación del cartucho a la observación, con un único plásmido reportero constitutiva como 35S:: GFP o 35S:: GUS. Se utilizó un 35S:: GFP plásmido obtenido de los Dres. Steve Monte y Zhang Xiaoning 6 (Figura 1 A, D). Los cartuchos de inyección de genes de control en la venta RioRad (Cat. 165-2244) no son adecuados para las plantas.
- Para BiFC, un control positivo es necesario, que debe constar de dos socios conoc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Dres. Steve Monte y Zhang Xiaoning para el 35S:: GFP pGlowbug la construcción y la Comunidad Hokensen Doctorado de Investigación en el laboratorio de CH Z. L's es apoyado por los EE.UU. National Science Foundation (IOB0616096 y MCB0744752). ZL es parcialmente financiado por la Universidad de Maryland Estación Experimental Agrícola.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
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