اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

Summary

في هذا الفيديو ، ونظهر عزلة blastocysts الماوس واشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية blastocysts. وصفنا أيضا الظروف الملائمة لصيانة الممتلكات الخلايا الجذعية ، وكذلك الحث التمايز في الثقافة.

Abstract

مواصفات الأديم الظاهر الغاذي هي واحدة من أقرب الأحداث تمايز التنمية الثدييات. نسب الأرومة الغاذية المستمدة من الأديم الظاهر الغاذي يتوسط الزرع ويولد الجنين جزء من المشيمة. نتيجة لذلك ، تطور هذه النسب ضرورية لبقاء الجنين. وكان أول وصف اشتقاق خلايا الأرومة الغاذية (TS) تنبع من blastocysts الماوس بواسطة تاناكا<em> وآخرون.</em> 1998. قدرة الخلايا TS للحفاظ على الممتلكات الخاصة والأرومة الغاذية التعبير عنها نوع من علامات محددة ومرحلة الخلية بعد التحفيز السليم يوفر نظام نموذجا قيما للتحقيق في الأرومة الغاذية التنمية النسب حيث تلخص أحداث المشيمة المبكر. وعلاوة على ذلك ، وخلايا الأرومة الغاذية هي واحدة من الأنواع القليلة الخلايا الجسدية الطبيعية التي تمر التضخيم الجينوم. على الرغم من أن المسارات الجزيئية الكامنة وراء polyploidization الأرومة الغاذية قد بدأت في الانهيار ، ودور الفسيولوجية والاستفادة من التضخيم الجينوم الأرومة الغاذية لا يزال بعيد المنال الى حد كبير. تطوير الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية ضعفاني المتعددة الصبغيات في الثقافة يجعل هذا<em> خارج الحي</em> النظام أداة ممتازة لتوضيح آلية تنظيمية من النسخ المتماثل الجينوم وعدم الاستقرار في الصحة والمرض. نحن هنا وصف بروتوكول استنادا إلى التقارير السابقة مع تعديل نشرت في تشيو<em> وآخرون.</em> 2008.

Protocol

في هذا البروتوكول ، ونحن تصف إعداد blastocysts الماوس وإنشاء خطوط الخلايا TS. التلاعب الماوس قبل عام لجمع blastocysts ، بما في ذلك إعداد لالتزاوج الطبيعي وتحريض الاباضة عظمى ، اتبع أساسا بروتوكول قياسي يتضح من ناجي وآخرون 2003 (pp146 – 150). الاش…

Discussion

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح عملية جمع E3.5 blastocysts من إجراءات الرحم والتجريبية لإنشاء خطوط الخلايا TS. كما وصفنا شرط للحفاظ على الخلايا stemness TS وللحث على التمايز إلى خلايا متمايزة. اثنين من الخطوات الحاسمة للحصول على خطوط خلايا نقي TS هي ثمرة توقيت التفكيك (الخطوة 9) ، وتجهيز ?…

Materials

Reagents

TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 10⁶/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).